林蛙油摻假分子生物學(xué)檢測方法的研究

王衛(wèi)芳，樓前，魏碧雙，顧肖巍，王婕，陳宇飛

（吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林 長春130507）

林蛙屬于兩棲綱林蛙屬生物，哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授趙文閣協(xié)同東北林業(yè)大學(xué)野生動物學(xué)院多名教授對其科學(xué)命名，把原來稱作中國林蛙、中國林蛙長白山亞種的林蛙，統(tǒng)一命名為東北林蛙。林蛙油是林蛙輸卵管的干燥物，是東北三省特有的野生珍貴特產(chǎn)，具有極高的藥用和保健價值。經(jīng)科學(xué)家鑒定主要成分為：蛋白質(zhì)、維生素a、維生素b、維生素c和18種氨基酸，鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等13種微量元素，具有抗疲勞、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌及性功能等作用。東北林蛙所產(chǎn)的油稱“大油”，黑龍江林蛙所產(chǎn)的油稱“小油”。除去這兩種林蛙以外的蛙油，均稱“偽油”，或“假油”。林蛙油摻假多樣，檢測方法也較多，本文主要闡述林蛙油摻假LAMP方法及微流控芯片技術(shù)。

1 摻假林蛙油

目前，市場摻假林蛙油較多，包括青蛙油、蟾蜍油、牛娃油等。東北林蛙油呈白色或黃白色，有些類似脂肪樣，有光澤、手感滑膩、有裂紋但不規(guī)則，質(zhì)地硬脆、易碎，有特殊氣味。黑龍江林蛙油與東北林蛙油性狀相似，也是白色或黃白色，也有油脂樣光澤，有潤滑感，但是顯微鏡下腺體細(xì)胞較小。青蛙油（黑斑蛙）是色白或黃白，也具哈蟆油一樣的油脂樣光澤。只是左右兩片形狀不對稱，但是氣味相差較大。蟾蜍油表面淡黃色至黃棕色，沒有光澤，半透明，質(zhì)地較硬，不易碎裂，具有特異腥臭，較容易區(qū)分。

2 林蛙油摻假檢測方法

林蛙油摻假檢測以前多從來源、性狀、顯微、理化等方面的研究。這些以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的鑒別方法簡便、易行，但會受到遺傳因素、林蛙的生長發(fā)育階段、自然環(huán)境的影響，同時在鑒別過程中容易受主觀因素的影響，重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，從而影響鑒定結(jié)果的可靠性。崔巖等對中國林蛙油鑒別方法提出建議，通過遺傳、指紋圖譜方面對林蛙油的鑒定已經(jīng)有了部分研究成果。侯曉東對東北林蛙油的理化性質(zhì)進行研究，通過紅外光譜、紫外光譜、薄層層析進行光譜分析檢測。

3 LAMP檢測方法

LAMP技術(shù)是日本科學(xué)家Notomi于2000年發(fā)明的試驗方法，可以在等溫條件下實現(xiàn)核酸擴增。LAMP技術(shù)的反應(yīng)原理是，根據(jù)序列保守區(qū)域設(shè)計的一對外引物，一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物特異性識別靶序列上的六個獨立區(qū)域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60℃～65℃范圍60分鐘內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA，同時伴隨有副產(chǎn)物白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列六個獨立區(qū)域，所以反應(yīng)特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，檢測時間大大縮短，而且快速敏感。

在Genebank上找到林蛙、中華蟾蜍、牛蛙、青蛙的保守序列，采用在線LAMP引物設(shè)計軟件對每種樣品分別設(shè)計5組特異引物；進行最佳引物篩選，選出反應(yīng)時間短、擴增效率高的引物；將篩選出的最佳引物進行特異性驗證，初步建立林蛙、中華蟾蜍、牛蛙、青蛙快速檢測體系，便可分別制作出單一品種摻假檢測的試劑盒。例如：青蛙油摻假檢測試劑盒、中華蟾蜍油摻假檢測試劑盒。該試劑盒不需要安規(guī)的儀器設(shè)備，只要一臺水浴鍋，便可以進行檢測，成本低，速度快，操作方便。

4 微流控芯片檢測

微流控芯片最初在美國被稱為“芯片實驗室”，在歐洲被稱為“微整合分析芯片”，隨著材料科學(xué)、微納米加工技術(shù)和微電子學(xué)所取得的突破性進展，微流控芯片也得到了迅速發(fā)展。微流控芯片技術(shù)是一項把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米級通道的芯片上，全過程自動化的對微量液體或樣品進行處理或控制的技術(shù)。它具有樣品處理時間短、檢測靈敏高、能耗和成本低等優(yōu)勢，而且可以實現(xiàn)檢測設(shè)備真正意義上的便攜化。

微流控蝶式芯片是基于LAMP技術(shù)的新型分子生物學(xué)檢測手段，有24個通道，同時進行多重檢測，一次取樣，同時實現(xiàn)林蛙油、中華蟾蜍油、牛蛙油、青蛙油的檢測。

5 結(jié)語

在傳統(tǒng)通過形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)、性狀以及理化檢測手段的基礎(chǔ)上，LAMP檢測方法作為新興的分子生物學(xué)檢測方法，特異性強、靈敏度高、檢測方便而快速（60min出結(jié)果），該方法必將得到廣泛的應(yīng)用。微流控芯片技術(shù)在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，將引物點樣于微米級通道內(nèi)，一次最多可以同時進行24個生物化學(xué)反應(yīng)，真正實現(xiàn)了高通量的多重檢測，在食品安全檢測領(lǐng)域，具有重大意義。

[1]崔巖,侯曉東,催春月,等.中國林蛙油鑒別方法研究進展及建議[J].林蛙養(yǎng)殖,2007(10):37-39.

[2]侯曉東.東北林蛙油的理化性質(zhì)及食療研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2014(08):179-180.

[3]高丹,鄭明珠,蔡丹,等.長白山林蛙油產(chǎn)品的研究現(xiàn)狀與開發(fā)[J]農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2010(06):73-75.