甘蔗對干旱脅迫的響應(yīng)及抗旱基因遺傳轉(zhuǎn)化研究進展

徐 榮 ，李富生 ，2，何麗蓮 ，2*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所，昆明 650201）

甘蔗（Saccharum officinarum L.）屬于禾本科、甘蔗屬植物，是世界和我國最主要的糖料作物，也是極具開發(fā)潛力的能源作物?，F(xiàn)代甘蔗栽培品種是由“甘蔗屬”內(nèi)的主要“種”（包括栽培種和野生種）通過“種間雜交”和“高貴化育種”選育而來[1]。甘蔗屬及其近緣野生種等種質(zhì)資源是甘蔗育種的基因庫。一般認為，甘蔗的高產(chǎn)、髙糖等性狀主要來自熱帶種（S.officinarum L.），而抗旱、耐寒、抗病蟲、分蘗等特性則主要來自野生種（如：割手密S.spontaneum L.，也稱細莖野生種）[2]。隨著甘蔗抗性育種不斷發(fā)展，育成的品種使得甘蔗種植區(qū)域逐漸從熱帶向亞熱帶和溫帶、從水田向丘陵旱地擴展[3]。甘蔗生長周期長，植株高大，對水分的需求量多，但由于我國甘蔗生產(chǎn)生態(tài)條件差（蔗區(qū)85%以上為旱坡地）[4]、干旱災(zāi)害頻繁，所以急需抗旱性強的甘蔗品種。盡管常規(guī)甘蔗育種（有性雜交育種）仍是目前選育抗旱品種的主要途徑，但由于甘蔗遺傳背景復(fù)雜，對于目標(biāo)性狀的獲得往往帶有很大的隨機性和偶然性，導(dǎo)致育種效率不高。近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用基因工程技術(shù)對甘蔗品種進行有針對性的遺傳改良已逐漸成為常規(guī)甘蔗育種途徑的有效補充。

1 甘蔗對干旱脅迫的響應(yīng)機制

甘蔗生長發(fā)育對水分的要求比較高，水分直接參與甘蔗的代謝、物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)化過程，嚴重缺水會影響甘蔗的萌芽、分蘗、伸長、葉片擴展、成熟等的生長發(fā)育過程，從而最終影響到甘蔗的產(chǎn)量及品質(zhì)。目前，我國有85%以上的蔗區(qū)分布在無灌溉條件的旱坡地，使得我國甘蔗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展很大程度受限于立地條件差以及干旱的頻繁發(fā)生。因此，對甘蔗栽培品種的抗旱適應(yīng)能力也就提出了越來越高的要求[4]，甚至在很大程度上，甘蔗品種的抗旱能力也就決定著甘蔗產(chǎn)業(yè)的效益和發(fā)展前景[2]。

許多甘蔗品種對干旱缺水可以有多種適應(yīng)方式，包括御旱性、耐旱性、避旱性等幾種方式，這些方式之間沒有嚴格的界限，御旱性和耐旱性被統(tǒng)稱為抗旱性。御旱性屬于形態(tài)學(xué)抗旱范疇，是指在水分脅迫下，甘蔗為了保持正常的生理生化狀態(tài)，通過限制水分的喪失維持體內(nèi)較高的水勢，使細胞處于正常的微環(huán)境中；耐旱性屬于生理生化抗旱范疇，是指甘蔗通過有機溶質(zhì)的累積有助于產(chǎn)生低的滲透勢，仍能保持細胞原生質(zhì)及其主要器官在嚴重脫水情況下減輕傷害，并迅速產(chǎn)生由脅迫應(yīng)答基因調(diào)控及表達相關(guān)的生理生化反應(yīng)[5]。

在水分脅迫下，甘蔗會調(diào)整下游相關(guān)基因的表達，也可以直接作為功能蛋白使植物細胞免受水分脅迫的影響，最終使植株表現(xiàn)出對水分脅迫的適應(yīng)性或抗耐性。目前，對植物干旱脅迫的分子機制尚不完全清楚。相關(guān)研究表明植物通過大量的Ca2+依賴激酶[6]、有絲分裂原相關(guān)激酶[7]等對下游蛋白進行可逆磷酸化，從而激活或抑制一系列的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因的表達，在這一過程中，植物激素乙烯、脫落酸（ABA）、乙酰水楊酸等含量會發(fā)生變化[8-9]，同時將干旱脅迫信號放大傳遞，從而改變植物的生理生化特征，提高抗旱能力，在植物的激素調(diào)節(jié)中，脫落酸處于中心地位。研究表明ABA不僅調(diào)控植物整個發(fā)育過程，同時也能在不同環(huán)境信號中起橋梁作用。ABA是植物細胞適應(yīng)干旱的關(guān)鍵因子，在植物抗逆反應(yīng)中起著重要作用，能夠啟動植物抗旱的響應(yīng)機制[10-11]。同時還發(fā)現(xiàn)，在干旱響應(yīng)過程中，ABA不僅能夠改變植物細胞的轉(zhuǎn)錄水平，而且能夠影響植物其他重要的基礎(chǔ)代謝過程，包括植物脂類代謝和碳代謝，這也從另一個方面暗示了ABA在這個植物響應(yīng)干旱的中心地位[12]。

2 與抗旱相關(guān)的幾類基因家族

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來越多的研究者克隆了與作物抗旱相關(guān)的基因，并就干旱脅迫誘導(dǎo)基因產(chǎn)物的功能及表達調(diào)控進行了深入研究。在甘蔗方面，近緣野生種斑茅的抗旱相關(guān)基因（deta-OAT、FKBP12，等）[13-14]和野生種割手密 3 個抗旱相關(guān)基因（ScNAC1、ScDREB、ScALDH）[15-17]已被克隆。

2.1 NAC類轉(zhuǎn)錄因子

NAC類轉(zhuǎn)錄因子是一類具有多種生物功能的植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，該基因家族在植物發(fā)育和逆境響應(yīng)中起重要作用[18]。NAC轉(zhuǎn)錄因子包含一個N端高度保守的結(jié)構(gòu)域和C端分化的調(diào)控域，N端包含5個亞結(jié)構(gòu)域(A~E)，由大約160個氨基酸殘基組成，B和E亞結(jié)構(gòu)域的保守性不強，A、C、D亞結(jié)構(gòu)域則高度保守，在C、D序列中包含核定位信號，因此NAC轉(zhuǎn)錄因子可與特定的啟動子元件相互識別，而NAC蛋白的C-末端區(qū)域則是高度發(fā)散的，從而使轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控出現(xiàn)多樣性[19]。

NACs在植物的生長發(fā)育過程中扮演著重要的角色，包括花的發(fā)育和形態(tài)的形成、芽頂端分生組織的形成和維持、胚胎的發(fā)育、激素的信號和次生壁的形成等。Guo和Gan[20]通過研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中克隆的AtNAP的NAC轉(zhuǎn)錄因子與葉片的衰老有關(guān)，其過量表達會造成植株的早熟性衰老。

植物的NACs基因與應(yīng)對生物和非生物脅迫是密切相關(guān)的，已應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因工程研究[21]。Sun等[22]在水稻中發(fā)現(xiàn)兩個響應(yīng)病原的NAC轉(zhuǎn)錄因子，分別為OsNAC122和OsNAC131，細胞定位發(fā)現(xiàn)其在細胞核并具有轉(zhuǎn)錄活性。在侵染稻瘟病菌后，OsNAC122和OsNAC131的表達被誘導(dǎo)，基因沉默則能夠提高稻瘟病菌的易感性。在轉(zhuǎn)基因水稻中，OsNAC6的過量表達呈現(xiàn)出對脫水、高鹽脅迫和稻瘟病的耐受性[23]。Luo等[24]發(fā)現(xiàn)SbSNAC1在高粱的干旱和鹽脅迫等非生物脅迫響應(yīng)中扮演著重要的角色，在高濃度條件下也在根中表達，其能夠響應(yīng)植物激素脫落酸。Nogueira等[25]從甘蔗中鑒定出了26個NAC類轉(zhuǎn)錄因子的家族成員，研究發(fā)現(xiàn)其中ScNAC23與低溫脅迫誘導(dǎo)有關(guān)，該基因的表達受水分脅迫和蟲害脅迫誘導(dǎo)。

2.2 DREB類轉(zhuǎn)錄因子

DREB(dehydration responsive element binding protein)類轉(zhuǎn)錄因子即缺水響應(yīng)元件結(jié)合蛋白，能特異地結(jié)合啟動子中含有DRE/CRT順式元件，在低溫、干旱和鹽堿等逆境脅迫下，通過調(diào)節(jié)下游逆境應(yīng)答基因的表達來提高植物的抗逆性。DREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白具有典型的結(jié)構(gòu)特征，富含堿性氨基酸的N-末端是核定位信號區(qū)，富含酸性氨基酸的C-末端是轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，中間由58個氨基酸殘基組成的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，特別是位于第2個β-折疊中的第14位的纈氨酸，在DREB轉(zhuǎn)錄因子與DRE順式元件的特異性結(jié)合起關(guān)鍵作用[26]。

干旱、低溫等逆境脅迫是如何激活DREB轉(zhuǎn)錄因子表達，Gilmour等[27]提出了ICE（Inducer of CBF Expression）理論，即在細胞中存在一個上游轉(zhuǎn)錄因子，它在常溫下以非活性形式存在，在低溫脅迫下可以被激活，并能與DREB的啟動子結(jié)合而開始轉(zhuǎn)錄。在DREB轉(zhuǎn)基因植物中，過表達可以激活靶基因的表達，提高植物對低溫、干旱等逆境的忍耐力。Dubouzet等[28]克隆了水稻DREB類轉(zhuǎn)錄因子OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C等基因，并發(fā)現(xiàn)水稻原生質(zhì)中的OsDREB1A、OsDREB1B能與DRE特異結(jié)合，在擬南芥中過表達OsDREB1A，可以提高其對干旱、高鹽和冷害的耐受力。Liu等[29]研究轉(zhuǎn)入35S∶DREB1Ab和35S∶DREB1Ac的轉(zhuǎn)基因擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株耐干旱脅迫的能力顯著高于野生型。Tian等[30]克隆了水稻DREB類轉(zhuǎn)錄因子：OsDREB1-1、OsDREB4-1、OsDREB4-2基因，在水稻幼苗中，OsDREB1-1和OsDREB4-2呈組成性表達，而OsDREB4-1受干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)表達，研究表明其可能在脅迫響應(yīng)通路中DRE/DREB作為反式作用因子行使功能。DREB轉(zhuǎn)錄因子具有復(fù)雜的作用機理，如DREB1A和DREB1D序列具有很高的同源性，DREB1D不能被低溫誘導(dǎo)但DREB1A可被低溫逆境誘導(dǎo)。功能相同的OsDREB1A和DREB1A，DREB1A能結(jié)合DRE的核心序列即ACCGAC和GCCGAC序列，而OsDREB1A只能特異結(jié)合GCCGAC序列[31]?？傊?，DREB轉(zhuǎn)錄因子對調(diào)控逆境誘導(dǎo)基因的表達起著關(guān)鍵作用，其能增強植物對多種逆境的適應(yīng)性和抵抗力，在提高植物綜合抗逆性方面有著廣闊的應(yīng)用前景。同時，鑒于DREB轉(zhuǎn)錄因子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、作用機理及基因表達等方面的復(fù)雜性，還需要對其進行更深層次的探討。

2.3 ALDH類醛脫氫酶

醛脫氫酶基因（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）是一類編碼將醛脫氫氧化為相應(yīng)羧酸的功能基因[32]。在環(huán)境脅迫下，生物體內(nèi)會產(chǎn)生醛類物質(zhì)，過量積累的醛類會與蛋白質(zhì)和核酸反應(yīng)并形成加合物，進一步破壞蛋白質(zhì)和核酸的正常結(jié)構(gòu)及功能。ALDH在生物體中具有四種主要功能：脫毒、參與代謝、滲透保護和NAD(P)H的再生[33]，ALDH基因家族具有一定保守性，但目前還未有關(guān)于植物ALDH保守區(qū)功能的研究和報道。

目前在植物中發(fā)現(xiàn)的ALDH包括14個家族，不同家族成員分別參與乙醛的氧化脫毒，參與鹽、干旱、重金屬、脫落酸等逆境脅迫的響應(yīng)[34]，其中最初從菠菜中分離得到的甜菜堿醛脫氫酶基因?qū)儆贏LDH10家族，是目前研究最多的一類ALDH基因，其催化甜菜堿醛脫氫氧化為甘氨酸甜菜堿，在干旱和鹽脅迫條件下，能誘導(dǎo)甜菜堿醛脫氫酶的上調(diào)表達，合成大量的甘氨酸甜菜堿，從而提高了細胞在逆境下滲透調(diào)節(jié)的能力[35]。ALDH還參與結(jié)氨酸降解為丙酰CoA的代謝途徑以及脯氨酸的代謝途徑等[36]。Gao等[37]檢測了干旱和鹽脅迫對水稻幼葉中不同ALDH基因家族表達的影響，發(fā)現(xiàn)水稻OsALDH2-4、OsALDH3-4、OsALDH7、OsALDH10-1和OsALDH18-2能同時被干旱和鹽脅迫上調(diào)表達，OsALDH2-2、OsALDH3-1和 OsALDH3-2同時被干旱和鹽脅迫下調(diào)表達。張積森等[38]在甘蔗中克隆了琥珀酸半醛脫氫酶（SSADH）基因，該基因參與甘蔗干旱脅迫下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并與鈣離子之間存在調(diào)控關(guān)系。最初發(fā)現(xiàn)于念珠藻中，后來在微生物中也發(fā)現(xiàn)了的ALDH21基因家族，干旱、ABA和NaCl處理均能誘導(dǎo)其蛋白的上調(diào)表達，表明ALDH21基因可能在植物應(yīng)對逆境脅迫時發(fā)揮重要作用[39]。ALDH對環(huán)境脅迫的響應(yīng)具有交叉性，研究ALDH應(yīng)對脅迫的響應(yīng)機理，將有助于我們深入了解ALDH緩解各種逆境脅迫的機制。

3 甘蔗抗旱轉(zhuǎn)基因研究進展

甘蔗遺傳背景復(fù)雜、高度雜合且無性繁殖，利用常規(guī)雜交育種方法難以準確實現(xiàn)定向遺傳改良，轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠有針對性地將外源基因?qū)氲礁收嶂?，加快甘蔗的育種進程。植物轉(zhuǎn)基因廣泛應(yīng)用基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，在甘蔗轉(zhuǎn)基因研究初期，主要使用基因槍法，具有不受宿主限制、靶受體類型廣泛、可控度高、操作簡便和快速等優(yōu)點。Bowers和Birch于1992年用基因槍法獲得了轉(zhuǎn)基因甘蔗[40]。隨著成功率高、遺傳穩(wěn)定性好的農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法不斷發(fā)展和優(yōu)化，其在甘蔗轉(zhuǎn)基因研究中逐漸得到廣泛應(yīng)用[41]。

由于甘蔗的抗旱性是由多基因控制的數(shù)量性狀，目前對甘蔗抗旱機制的了解還非常有限，甘蔗抗旱轉(zhuǎn)基因研究基本是從抗旱功能基因和轉(zhuǎn)錄因子以及蛋白激酶類信號因子等方面開展的。抗旱功能基因編碼的蛋白質(zhì)在干旱脅迫下對細胞直接起保護作用，主要包括滲透調(diào)節(jié)劑脯氨酸、甜菜堿、果聚糖、甘露醇等，過氧化保護劑超氧化物歧化酶、過氧化酶、過氧化氫酶等，以及分子伴侶晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白、水通道蛋白等。Zhang等[42]研究顯示海藻糖合成酶轉(zhuǎn)基因甘蔗中海藻糖含量達8.805～12.863mg/g，而非轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)未檢測到海藻糖的含量，通過測定一系列生理指標(biāo)，表明轉(zhuǎn)海藻糖合成酶基因甘蔗的抗旱性顯著增強。Molinari[43]等對脯氨酸合成酶轉(zhuǎn)基因甘蔗進行了功能驗證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因甘蔗在水分虧缺時可誘導(dǎo)脯氨酸大量積累，起到滲透調(diào)節(jié)劑的作用從而提高了抗旱性。在非生物脅迫過程中產(chǎn)生的一類對下游基因具有重要調(diào)控作用的蛋白即是轉(zhuǎn)錄因子，依據(jù)轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)域的不同可分為MYB、bZIP、NAC和DREB等不同轉(zhuǎn)錄因子家族，過量表達SNAC1的轉(zhuǎn)基因水稻，營養(yǎng)和生殖生長期的耐旱性都顯著提高[44]。Sruthy[45]等將從斑茅中克隆得到的EaHSP70基因?qū)敫收?，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更高的細胞膜熱穩(wěn)定性、葉綠素含量和光合效率。Anisur[46]分析了TERF1和TSRF1轉(zhuǎn)基因甘蔗與野生型之間的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)與干旱脅迫相關(guān)的蛋白大多數(shù)具有酸性跨膜、富含疏水氨基酸、穩(wěn)定性好的特點。Wu等[47]成功構(gòu)建了rd29a-dreb-hyg表達載體，該表達載體已成功轉(zhuǎn)導(dǎo)到甘蔗中。總之，有關(guān)外源轉(zhuǎn)錄因子及蛋白激酶抗旱基因直接轉(zhuǎn)化水稻、玉米等單子葉植物的研究報導(dǎo)比較多，而且取得了成功，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性能有較大提高，但是甘蔗這方面的研究相對較少。

綜上所述，在現(xiàn)代分子生物學(xué)快速發(fā)展的今天，隨著生物技術(shù)手段及生物信息學(xué)的不斷完善，人們對植物抗旱分子機理的研究得以深入探討，在沒有甘蔗完整基因組的情況下，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展與完善，研究者利用該技術(shù)挖掘出一批甘蔗抗旱基因，并進行了基因克隆，取得了一定的成果。接下來應(yīng)在繼續(xù)挖掘抗旱基因的基礎(chǔ)上，開展甘蔗抗旱基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究，真正地將理論轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。由于植物抗旱性能是由多個基因控制的數(shù)量性狀，孤立地針對單一基因研究并不能全面揭示植物抗旱的分子機理，并且單個基因的遺傳轉(zhuǎn)化對植物抗旱性的提高也有限，通過探討多基因共轉(zhuǎn)導(dǎo)對植物抗旱效應(yīng)的影響，是未來甘蔗轉(zhuǎn)基因工程研究的一個重要發(fā)展方向。