分子技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

□ 鄭 波 山東省安丘市疾病預(yù)防控制中心

目前，國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)中微生物檢測(cè)方法（GB 4789—2016）屬于傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)方法。該方法所需設(shè)備簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟、準(zhǔn)確性較高，但缺點(diǎn)也十分明顯，過程復(fù)雜、耗時(shí)、耗力、耗材、無(wú)法對(duì)微生物進(jìn)行快速檢測(cè)。近年來(lái)，新興起的分子技術(shù)站在RNA、DNA水平上將一些微生物檢測(cè)出來(lái)，其在食品微生物檢驗(yàn)方面的優(yōu)勢(shì)日漸凸顯，已成為一種重要的食品微生物檢測(cè)方法。

1 基因探針技術(shù)

核酸原位雜交和膜上印跡雜交是在食品微生物檢測(cè)中最常用的2種基因探針技術(shù)，其具有定位性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)易、特異性好及靈敏度高等諸多特點(diǎn)。目前，食品中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌等大多數(shù)微生物都可以通過特異性的基因探針檢測(cè)出來(lái)。

2 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)即聚合酶鏈反應(yīng)，出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，是一種能短時(shí)間內(nèi)體外快速擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增技術(shù)。因其具有產(chǎn)率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好及易自動(dòng)化等特點(diǎn)，在食品微生物檢測(cè)方面應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

2.1 常規(guī)PCR

早在20年前，科研人員就采用傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)[1]。目前，PCR技術(shù)能實(shí)現(xiàn)大多數(shù)食品微生物檢出率在99%以上。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是指通過對(duì)PCR反應(yīng)體系中加入的熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。因其具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高、可實(shí)時(shí)定量、特異性強(qiáng)、靈敏度高、交叉污染少及自動(dòng)化程度高等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在食品微生物檢測(cè)中應(yīng)用越來(lái)越多。

2.3 多重PCR

多重PCR具有同時(shí)對(duì)多個(gè)微生物基因進(jìn)行檢測(cè)的特點(diǎn)，在食品中多種微生物的同時(shí)檢測(cè)應(yīng)用十分廣泛。如金黃色葡萄球菌具有較多毒力基因，可采用多重PCR方法對(duì)金黃色葡萄球菌中多個(gè)毒力相關(guān)基因進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，可以檢出微生物，了解微生物含毒力相關(guān)基因的致病性的強(qiáng)弱和數(shù)量多少。

2.4 免疫PCR

免疫PCR，是在20世紀(jì)90年代初研發(fā)出來(lái)的一種檢測(cè)微量抗原的高靈敏度技術(shù)手段，可以將抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性進(jìn)行有機(jī)融合，利用一段已知DNA分子對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記作為探針，在抗原抗體復(fù)合物上PCR對(duì)這段DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增粘附、電泳定性，按照相關(guān)的特異性PCR產(chǎn)物的有無(wú)，來(lái)對(duì)待測(cè)抗原是否存在進(jìn)行判斷。

2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，即RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，其工作原理是提取細(xì)胞中的RNA，將其作為模板獲取cDNA，之后有效擴(kuò)增PCR。反轉(zhuǎn)錄PCR方法不僅可以應(yīng)用于食品微生物RNA檢測(cè)，也用來(lái)檢測(cè)在生長(zhǎng)或侵染過程中食品微生物特定基因的表達(dá)變化量。

3 基因芯片技術(shù)

基因芯片的概念來(lái)源于計(jì)算機(jī)芯片，通過將大量按檢測(cè)要求設(shè)計(jì)好的探針固化，能一次雜交、檢測(cè)出多種靶基因的微生物，具有高精確度、高精密度和高靈敏度分析、多參數(shù)同步分析、快速全自動(dòng)分析等特點(diǎn)，這對(duì)于建立靈敏高效的食品檢測(cè)體系有著傳統(tǒng)方法無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)，成為目前鑒別食品微生物的最有效的手段之一。目前，我國(guó)已將此技術(shù)引入國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn)中，如《出口食品中致瀉大腸埃希氏菌檢測(cè)方法 基因芯片法》（SN/T 3152—2012）等。

4 免疫分析法

4.1 酶聯(lián)免疫分析法

目前，ELISA試劑盒是最成熟的技術(shù)，微生物檢測(cè)一般采用夾心模式，在獲得微生物特異性抗原抗體之后，就能開發(fā)出靈敏度高和特異性強(qiáng)的快速檢測(cè)ELSIA試劑盒。目前，進(jìn)口產(chǎn)品主要有美國(guó)Transia系列、荷蘭Biocheck酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒等，國(guó)產(chǎn)則是良潤(rùn)生物公司等生產(chǎn)的ELISA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)品種主要包括食品中的志賀氏菌、沙門氏菌、單增李斯特、金黃色葡萄球菌等微生物。

4.2 膠體金檢測(cè)卡

該技術(shù)工作原理是以層析膜作為反應(yīng)載體，以膠體金作為顯色信號(hào)，將所需試劑都集成到檢測(cè)卡或檢測(cè)紙條上，加入待測(cè)樣品后20 min內(nèi)就能肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，因此非常適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。目前，進(jìn)口產(chǎn)品主要是美國(guó)SDIXRapid Check系列，國(guó)產(chǎn)則是良潤(rùn)生物公司生產(chǎn)的膠體金測(cè)試卡，檢測(cè)品種主要包括食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等微生物。

5 其他分子技術(shù)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，很的分子技術(shù)不斷被應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，如核糖體間隔區(qū)分析技術(shù)、核糖體RNA基因分析技術(shù)、基因重組法、生物傳感器技術(shù)、DNA指紋圖譜技術(shù)和功能性基因差異的DNA圖譜技術(shù)等。

傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法已逐漸難以滿足現(xiàn)代社會(huì)對(duì)食品微生物快速精確檢測(cè)的需求，分子技術(shù)憑借操作簡(jiǎn)便、靈敏高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)正逐漸成為微生物分類鑒定的主要手段，可使微生物的檢測(cè)逐步向靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性大、簡(jiǎn)易經(jīng)濟(jì)的方向不斷發(fā)展。目前應(yīng)用于食品微生物鑒定方面的分子技術(shù)還相對(duì)有限，大多還處在實(shí)驗(yàn)室階段，大部分僅能作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的參考。