食品中黃曲霉毒素B1柱后光化學衍生-高效液相色譜檢測法研究

□ 黃 軒 銅川市產品質量監(jiān)督檢驗所

1 高效液相色譜-柱后衍生法的優(yōu)勢

目前，對黃曲霉毒素B1（AFB1）的檢測主要以《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB5009.22-2016）的規(guī)定為主，有以下幾種：同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質譜法、高效液相色譜-柱前衍生法、高效液相色譜-柱后衍生法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法與薄層色譜法等。在測定黃曲霉毒素過程中主要方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫修復篩選法、同位素稀釋液相色譜—串聯(lián)質普法三種方法[1]。其中薄層色譜法相對復雜，試劑消耗相對較大，對于人們身體會產生極大的危害，方法專一性相對較差，屬于一種半定量方法。而相較于薄層色譜法來說，酶聯(lián)免疫修復篩查法步驟上相對簡單，但所需要的抗體的壽命需要低溫保存，壽命非常短暫，保存難度非常高，同時檢測所得的結果上會出現(xiàn)較高的陽性率，在大量樣品的大范圍篩選中應用較為廣泛，但無法實現(xiàn)對樣品的精準定量。相較于以上兩種方法來說同位素稀釋液相色譜—串聯(lián)質普法此種檢測方法檢測靈敏度相對較高，但設備昂貴、實驗成本非常高，對于很多實驗室來說并不具備使用此類方法的實驗條件。

AFB1在不同條件之下會出現(xiàn)不同的反應，在水溶液中會出現(xiàn)熒光淬滅，但在紫外線激發(fā)作用之下會出現(xiàn)熒光，可以通過三氟乙酸柱前衍生-HPLC法、碘或溴柱后衍生-HPLC法、光化學柱后衍生-HPLC法等三種衍生法來提升AFBI的熒光信號[2]。

光化學柱后衍生-HPLC法是采用光化學衍生器內部是一定長度的聚四氟乙烯管固定于254 nm紫外燈照射的不透光的反應池架里，當AFB1流過時，受到紫外光的照射后使AFB1的熒光性增強，從而提高檢測靈密度。因此光化學柱后衍生-HPLC法在使用了光化學衍生器后不需要其他化學試劑，只是連接到色譜柱和檢測器之間，其操作簡單，重復性好，靈密度高。

2 黃曲霉毒素B1檢測的材料和方法

2.1 儀器和試劑

島津LC-20AT高效液相色譜儀、RF-20A熒光檢測器、Milli-Q型純水機、月旭光化學衍生器、AFB1標準品、甲醇色譜純等。

2.2 檢測樣品前處理

首先將樣品玉米研磨粉碎，顆?？刂圃? mm左右，稱取5 g樣品于50 mL的離心管中，加入1 g氯化鈉，再加入70%的甲醇溶液離心管液面到25 mL；蓋上瓶蓋輕微震蕩讓其混均勻，再將溶液在均質器提取大約2分鐘，將溶液玻璃纖維慮紙過濾，吸取液3 mL加6 mL超純水再經玻璃纖維慮紙過濾，吸取3 mL過濾液以不大于2 mL/min流速通過免疫親和柱，以10 mL超純水淋洗后吹干去除水分，準確加入1 mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液并準備上機。

2.3 色譜條件

色譜柱：月旭C18柱（4.6×250 mm，5 μm）。流動相：甲醇∶水=45∶5。熒光檢測器激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min。

2.4 標準溶液的配制

AFB1標準品1 mg/L 1 mL一瓶，用甲醇溶液定容10 mL容量瓶把它稀釋 成 2.5、5、10、20、40 ng/mL的系列AFB1標準工作溶液。

2.5 加標回收實驗室

取樣品加入10 ng/mL AFB1標準工作溶液1 mL，進行加標回收實驗。

3 結果與討論

3.1 方法的線性范圍及檢出限用

分別檢測2.5、5、10、20、40 ng/mL的系列AFB1標準溶液，以待測AFB1標準的濃度為橫坐標，響應峰面積為縱坐標，計算并繪制標準曲線。結果表明AFB1在2.5～40 ng/mL范圍內，峰面積和濃度呈良好的線性關系，線性方程式為Y=aX+b，相關系數(shù)為R為0.999 2。

3.2 加標回收利率

樣品加入10 ng/mL AFB1標準工作溶液1 mL，進行樣品前處理上機，樣品檢測結果9.75 ng/mL, 回收率為97.5%。

4 結論

光化學柱后衍生-HPLC法相比其樣品前處理簡單、儀器成本較低、專一性高、靈密度高、準確度高等優(yōu)勢。食品安全在現(xiàn)如今人們的日常生活中所受到的關注程度越來越高，而食品中的黃曲霉素B1其危害性非常高，所以在食品檢測過程中針對黃曲霉素B1的檢測方法也在不斷進行改善，發(fā)揮出了非常顯著的作用。今后隨著時代的發(fā)展，食品中黃曲霉素的檢測方法還會不斷進步。