中國(guó)乙型腦炎病毒株的毒力變異和減毒活疫苗的研究

俞永新

100050北京,中國(guó)食品藥品檢定研究院

自1949年以來(lái)，中國(guó)學(xué)者從自然界分離到數(shù)百株乙型腦炎病毒株并對(duì)其進(jìn)行過(guò)病毒的生物學(xué)特性、致病性、抗原性、毒力變異和疫苗的研究[1-6]，積累了大量的寶貴資料，為闡明乙腦在自然界的流行規(guī)律和對(duì)乙腦的防控、疫苗研制等提供重要科學(xué)數(shù)據(jù)，其中特別是對(duì)自然界乙腦分離株間的神經(jīng)毒力差異及其機(jī)制，以及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)毒株的毒力變異和減毒活疫苗的系統(tǒng)研究，獲得突出的成績(jī)，達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。

1 中國(guó)乙腦病毒分離株的毒力研究

20世紀(jì)50年代，黃禎祥等[7]在北京從乙腦患者、蚊蟲、豬血分離到共53株乙腦病毒，并對(duì)這些分離株進(jìn)行3周齡小鼠的腦內(nèi)和皮下毒力的比較。結(jié)果顯示所有的毒株對(duì)小鼠的腦內(nèi)毒力相差不大，LD50滴度(對(duì)數(shù))一般都在7.5～9.0之間，但發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源毒株都存在皮下毒力高低不同的毒株，皮下毒力高者達(dá)6.1～8.1 lgLD50，低者只有1.0～3.0 lgLD50。若以腦內(nèi)和皮下LD50滴度(對(duì)數(shù))差值＜3.0(高皮下毒力)計(jì)算，則從人體分離的23株中有8株(8/23)、蚊體分離的12株中只有2株(2/12)、從豬體分離的20株中最少只有3株(3/20)。提示自然界確實(shí)存在皮下毒力高低不同的乙腦毒株，其中從乙腦死亡病例中分離的高毒力株居多?？赡芷は露玖?qiáng)的病毒容易通過(guò)大腦屏障侵入腦內(nèi)有關(guān)。王逸民等[8]進(jìn)一步研究不同年代不同來(lái)源10株病毒的致病性，結(jié)果也顯示毒株間存在明顯的皮下毒力差異。毒力高者腦內(nèi)/皮下的LD50差值僅為1.0～1.5 lg，低者為4.33 lg，毒力高者，空斑形態(tài)普遍較大，但不同時(shí)期的分離株未見(jiàn)差異。

李河民等[9]比較4株乙腦病毒腦內(nèi)和皮下致病性，發(fā)現(xiàn)病毒的腦內(nèi)毒力無(wú)明顯差別，LD50滴度(對(duì)數(shù))為8.0～8.4，但皮下毒力有很大差別，P3和P1株LD50滴度(對(duì)數(shù))分別＞5.0和5.17，而47株和廣譚株均＜0.75。黃禎祥等[10]曾對(duì)P1株和中山(Nak)株的感染力進(jìn)行比較，分別以不同途徑接種3周齡小白鼠，結(jié)果P1株不同代次腦內(nèi)感染的LD50滴度(對(duì)數(shù))平均為8.6，Nak株平均8.2，二者無(wú)明顯差別。但兩株病毒皮下接種感染的結(jié)果差別很大，P1株LD50滴度(對(duì)數(shù))平均值為7.6，而Nak株平均值滴度＜1.3，表明二者皮下致病力有顯著差別。

近年來(lái)，劉欣玉等[11]對(duì)國(guó)內(nèi)分離的毒株和以往的分離株共17株進(jìn)行小鼠(12～14 g)腦內(nèi)和皮下的毒力比較，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)毒株間腦內(nèi)毒力無(wú)明顯差別，但毒株間皮下毒力差異明顯。毒力低的毒株如HLJ02-144株，其 LD50滴度(對(duì)數(shù))僅為4.30；而毒力強(qiáng)的毒株如02-41株，滴度高達(dá)7.67，但毒力在兩種基因型間無(wú)差別。分析毒株的毒力和毒株來(lái)源的關(guān)系，可見(jiàn)從患者分離的6株中4株的毒力為高和中等水平，結(jié)果與黃禎祥等早期的報(bào)告一致。說(shuō)明人分離株的毒力普遍較強(qiáng)，其原因可能是自然界侵入人腦而致病的病毒一般毒力較強(qiáng)。分離自黑龍江省的毒株共有3株，其毒力均在中等和低水平，其原因可能是由于黑龍江氣溫較低，病毒在蚊體內(nèi)和動(dòng)物宿主內(nèi)的復(fù)制周期短，病毒變異機(jī)率少有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

乙腦毒株間的腦內(nèi)毒力差異雖較少發(fā)現(xiàn)，但亦曾有報(bào)告。黃禎祥等[12]從三帶喙庫(kù)蚊分離到31株乙腦病毒，用3周齡小鼠比較其腦內(nèi)毒力，發(fā)現(xiàn)病毒滴度TCID50/LD50存在差異，有5株毒力低的毒株，其中2株比值為3.17 lg，3株為2.17～3.0 lg；其余26株毒力較高的毒株，其比值＜2.0，表明毒株間腦內(nèi)毒力亦存在一定差異。

陳伯權(quán)等[13]對(duì)印尼分離的5株乙腦病毒進(jìn)行小白鼠的腦內(nèi)和皮下毒力實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)毒力明顯差異，毒力高者病毒滴度PFU/LD50比值僅為0.83，低者為3.23。將低毒力病毒株進(jìn)行空斑克隆，在10個(gè)空斑中出現(xiàn)4個(gè)空斑病毒的PFU/LD50＞5.00，對(duì)低毒力的病毒又進(jìn)行第2次空斑克隆，結(jié)果出現(xiàn)3株以6.0 lg PFU病毒接種3周齡小鼠腦內(nèi)不致死的病毒。

近年在中國(guó)臺(tái)灣1個(gè)小島上從騷擾阿蚊中分離到1株對(duì)乳鼠腦內(nèi)致病力很弱的TIPI株，其LD50為2.44×106PFU較分離自其他地區(qū)的CH1 392株毒力(2.87×102PFU)明顯較低。而該島上居民的乙腦抗體陽(yáng)性率雖然較高(48.8%)，且抗體水平隨年齡增長(zhǎng)而升高，但該島多年未發(fā)現(xiàn)臨床乙腦病例[14]。分析其原因可能是由于弱毒株不引起臨床表現(xiàn)，但可以產(chǎn)生隱性感染。SA4株其腦內(nèi)毒力(LD50)雖與其他乙腦毒株相似，但小鼠腦內(nèi)接種后，病毒在腦內(nèi)的增殖速度較其他毒株顯著迅速，引起動(dòng)物發(fā)病和死亡的時(shí)間更快，呈暴發(fā)型，與其他毒株比較死亡時(shí)間要提前約24 h，同時(shí)腦內(nèi)病毒滴度的高峰也提前1 d[15].

以上結(jié)果表明自然界確實(shí)存在腦內(nèi)和皮下毒力高低的乙腦病毒株，該結(jié)果可以解釋人類受感染后有輕重不同臨床表現(xiàn)及顯性和隱性感染的主要原因。

黃禎祥等[16]對(duì)神經(jīng)外毒力差異的機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)毒力高的毒株在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的病毒血癥持久時(shí)間長(zhǎng)，如高皮下毒力的P1株，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6 d，而低毒力的M47和Nak株，病毒血癥時(shí)間僅為2 d。而且在體外實(shí)驗(yàn)顯示，皮下毒力高的毒株對(duì)溫度的穩(wěn)定性亦較高。將P1和Nak株病毒液置37℃水浴內(nèi)，Nak株56 h檢測(cè)陰性，而P1株置72 h仍可測(cè)出1.62 lg病毒。汪瑾等[17]還觀察到不同毒力病毒株在小鼠體內(nèi)不同臟器如肝、脾、心，腎等的繁殖能力相差很大，如P1株的繁殖力強(qiáng)，臟器內(nèi)病毒滴度普遍高于Nak株，存在的時(shí)間亦較長(zhǎng)。病毒侵入腦內(nèi)的時(shí)間早，如以小劑量病毒靜脈注射則各臟器內(nèi)的病毒量，A2株普遍較高，NaK株則測(cè)不出病毒。

黃禎祥[18]將皮下毒力強(qiáng)的京衛(wèi)研1(A2)在不同鼠齡以不同途徑傳代的毒力變異研究，結(jié)果顯示在鼠腦傳代過(guò)程中，皮下毒力隨著傳代次數(shù)的遞增而下降，降低的速度又與傳代用小鼠的鼠齡密切關(guān)系。即鼠齡越大，腦內(nèi)傳代后皮下毒力下降越快，下降幅度越大。如將A2株在7日齡、3周、5周和1年齡小鼠的腦內(nèi)傳代時(shí)，經(jīng)7日乳鼠腦內(nèi)傳代的病毒到145代時(shí)，才可見(jiàn)毒力明顯下降，在3周小鼠腦內(nèi)傳代的病毒，到113代后，皮下毒力已下降到4.5lg LD50，在5周鼠腦內(nèi)傳代時(shí)到113代后皮下毒力已下降至1.0～1.3lg LD50，而在1年鼠腦內(nèi)傳代的毒力到118代時(shí)已失去其皮下毒力。但是如病毒通過(guò)小鼠皮下接種傳代，皮下毒力不降低。另外將鼠腦內(nèi)傳代后皮下毒力降低的變異株，通過(guò)同齡小鼠皮下傳代，皮下毒力可以回轉(zhuǎn)增強(qiáng)。如皮下毒力降低為2.7lg LD50的變異株，通過(guò)皮下傳代115代后皮下毒力又增強(qiáng)至7.1lg LD50.

以上結(jié)果顯示病毒變異是通過(guò)適應(yīng)過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)的，一方面與原來(lái)病毒的特性有關(guān)，另一面則取決于環(huán)境，環(huán)境越不同于病毒原來(lái)的生存條件，病毒發(fā)生變異的時(shí)間就越快，幅度越大。

2 中國(guó)乙腦減毒活疫苗的研究

20世紀(jì)50年代開(kāi)始，中國(guó)病毒學(xué)研究人員不斷探索研究乙腦的減毒活疫苗，取得重大的成果，其中1株SA14-14-2株已得到WHO和國(guó)際公認(rèn)，是1株高度減毒安全長(zhǎng)效的疫苗株，另一些毒株雖然沒(méi)有獲得生產(chǎn)許可證，但在病毒毒力減弱、免疫原性提高技術(shù)和規(guī)律上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)乙腦和其他黃病毒減毒活疫苗的研究具有十分有益的參考價(jià)值。

2.1 雞胚細(xì)胞傳代減毒株

2.1.1 雞胚細(xì)胞連續(xù)傳代后的毒力變異:李河民等[19]將乙腦P3株在雞胚組織塊細(xì)胞37℃培養(yǎng)連續(xù)傳代，隨著傳代代次的增加，對(duì)小鼠的皮下毒力逐步下降，對(duì)10～12 g小鼠已失去致病力，對(duì)乳鼠的毒力也降至3.0 1 g。但腦內(nèi)毒力未見(jiàn)降低，在129代時(shí)腦內(nèi)毒力仍高達(dá)4.5～5.5 lg，繼續(xù)傳至230代，同時(shí)另1組自138代置41℃培養(yǎng)119代共計(jì)257代，結(jié)果腦內(nèi)毒力均未見(jiàn)降低。

以后又另選SA4(1952年由汪美先在西安乙腦病例分離株)和Lm株(1956年由俞永新在北京市從乙腦患者腦分離出)在相同的體外雞胚組織塊細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)傳代[20]，結(jié)果Lm株在37℃?zhèn)髦?89代。王用楫等[21]用P3株乙腦病毒在雞胚細(xì)胞連續(xù)傳140代獲得一株C系減毒株，其對(duì)7～9 g小白鼠腹腔毒力明顯降低，由第1代的4.8 lg LD50下降至以病毒原液接種時(shí)僅個(gè)別小鼠發(fā)病死亡(≤10%)。腦內(nèi)的毒力也有一定下降，但不明顯，由第1代的5.8 lg LD50下降至2.5～4.0 lg之間。以C株第24、57、119代活毒免疫小鼠1劑，免后14 d以活毒腹腔攻擊，結(jié)果保護(hù)指數(shù)高達(dá)百萬(wàn)以上，免疫組小鼠僅在攻擊后2或3 d在局部和對(duì)側(cè)淋巴腺和血液查到病毒而對(duì)照組小鼠，則于1～6 d內(nèi)在淋巴腺、血液、肝、脾和腦等組織廣泛存在病毒。表明該減毒株具有良好的免疫原性。

王用楫等[22]進(jìn)一步以C株對(duì)仔豬進(jìn)行免疫觀察以1.0和10 ml分別接種6只仔豬，抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為2/6和5/6。

2.1.2 雞胚細(xì)胞傳代加乳鼠皮下傳代減毒株[23]:上述SA4株雞胚細(xì)胞傳代后的皮下毒力完全喪失，腦內(nèi)毒力僅有一定的下降但免疫原性很差。為提高其免疫性，將SA4雞胚細(xì)胞203代病毒在1～3日齡乳鼠皮下傳代，接種病毒后4 d，收取局部皮膚和皮下組織及淋巴結(jié)混合研磨后，以10-1懸液接種雞胚細(xì)胞培養(yǎng)增殖病毒后，再以同法接種乳鼠皮下，交替?zhèn)鞔?2代后，單在乳鼠皮下連傳3代，共計(jì)15代，獲得毒株命名為SA4SM株。對(duì)SA4SM株毒力和免疫力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SA4SM株腦內(nèi)毒力較未經(jīng)乳鼠皮下傳代的病毒毒力約下降2.0 lg。將SA4SM株做空斑克隆純化，結(jié)果，5個(gè)空斑中有4個(gè)對(duì)小鼠的腦內(nèi)不致病或個(gè)別致死，僅1個(gè)空斑病毒的毒力為2.0 lg。而未經(jīng)乳鼠皮下傳代的病毒5個(gè)空斑中的腦內(nèi)毒力高達(dá)2.0～4.0 lg。

為考核實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，又將SA4 CEC279代病毒按同法，在乳鼠皮下傳6代。結(jié)果從第1代開(kāi)始各代病毒均較原始株毒力下降1.0～2.0 lg。但有趣的是，雖然第1代和6代病毒的毒力無(wú)明顯差別，但經(jīng)空斑克隆后，則發(fā)現(xiàn)在相同病毒感染量的情況下，第6代中，9個(gè)空斑病毒普遍較低，LD50在0.61～1.78 lg，而第1代中的7個(gè)空斑病毒毒力明顯較高，為2.0～3.37 lg。以上結(jié)果提示病毒可以通過(guò)乳鼠皮下傳代快速減毒，其機(jī)理可能與病毒在非神經(jīng)組織內(nèi)的選擇適應(yīng)，淘汰嗜神經(jīng)病毒顆粒有關(guān)。

為進(jìn)一步篩選到毒力更低特別是對(duì)小鼠腦內(nèi)無(wú)致病性的減毒株，作者又對(duì)SA4SM株進(jìn)行連續(xù)6次的空斑篩選，每次選毒力最低的空斑病毒作為代表株進(jìn)行下一輪純化，結(jié)果在前5輪的純化中，數(shù)十株空斑病毒的腦內(nèi)毒力，普遍較低，但病毒原液對(duì)小鼠仍有半數(shù)死亡或僅死亡1只，未達(dá)到對(duì)小鼠腦內(nèi)完全不致病的程度。因此又進(jìn)行第6次空斑純化，結(jié)果8個(gè)空斑中只有2個(gè)對(duì)小鼠死亡1只，其余6個(gè)均對(duì)小鼠均不致病。為了解這8個(gè)空斑的毒力穩(wěn)定性，進(jìn)行了小鼠腦內(nèi)回傳實(shí)驗(yàn)(返祖實(shí)驗(yàn))，結(jié)果一個(gè)空斑病毒經(jīng)腦內(nèi)傳至第3代毒力仍為0，第4代時(shí)略有回升，≥2.5 lg LD50；另一個(gè)空斑傳至第4代毒力為0，到第5代，PFU為5.69 lg，LD50仍低至1.0 lg LD50，表明這株病毒不但對(duì)小鼠腦內(nèi)無(wú)致病性，而且毒力十分穩(wěn)定，無(wú)返祖現(xiàn)象，達(dá)到制備減毒活疫苗的低毒力和遺傳穩(wěn)定性的穩(wěn)定水平。

作者進(jìn)一步對(duì)乳鼠皮下傳代后病毒及其克隆株的免疫性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示通過(guò)乳鼠皮下傳代后的病毒株，免疫原性有極大的提高，免疫保護(hù)指數(shù)提高萬(wàn)倍，如傳代前的原始株CEC279代病毒的保護(hù)指數(shù)為＜10，而SA4SM株為1萬(wàn)，其空斑純化克隆株的免疫指數(shù)亦高達(dá)萬(wàn)至10萬(wàn)，其中高度減毒株SA4SM-6克隆株的指數(shù)為13萬(wàn)[23]。

以上結(jié)果顯示通過(guò)乳鼠皮下傳代不但病毒的神經(jīng)毒力極大下降，而且免疫原性也極大提高，原因應(yīng)該是病毒提高了在機(jī)體皮下和周圍淋巴組織的復(fù)制和繁殖能力，促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)病毒抗原的應(yīng)答。

2.2 地鼠腎細(xì)胞傳代減毒株 以地鼠腎細(xì)胞傳代為主并結(jié)合其他手段對(duì)乙腦病毒進(jìn)行毒力減弱的減毒株有以下數(shù)株。

2.2.1 SA14-14-2株[24-25]

2.2.1.1 減毒歷史:通過(guò)不同乙腦病毒分離株的生物學(xué)特征、抗原性和免疫原性的研究比較后選用1954年由汪美先分離自西安庫(kù)蚊幼蟲的SA14株鼠腦11代病毒作為母株進(jìn)行減毒，采用地鼠腎細(xì)胞連續(xù)傳代技術(shù)，但不是傳統(tǒng)的低溫(32℃ ～34℃)培養(yǎng)，而采用36℃ ～37℃下培養(yǎng)，經(jīng)地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)傳100代后，病毒對(duì)10～12 g幼鼠的腦內(nèi)毒力由原來(lái)的8.0 lg下降至3.7 lg/0.03 ml[26]，經(jīng)蝕斑克隆后，從9株毒力不同(LD50＜0.0～5.50 lg)的空斑病毒中，選出1株對(duì)小鼠腦內(nèi)注射僅個(gè)別發(fā)病的弱毒克隆株(12號(hào))，對(duì)12號(hào)病毒進(jìn)行空斑2次克隆獲得1株腦內(nèi)毒力僅對(duì)個(gè)別小鼠發(fā)病的12-1-7株[27]。

但12-1-7株的弱毒很不穩(wěn)定，經(jīng)細(xì)胞傳數(shù)代或小鼠腦內(nèi)傳1代，毒力迅速回升恢復(fù)至接近其母株SA14的毒力水平，以后雖經(jīng)2次的空斑克隆純化，但仍未能篩選到弱毒穩(wěn)定不返祖的弱毒株。隨后，進(jìn)行第二步減毒，采取一種具有一定創(chuàng)新性的手段，即通過(guò)動(dòng)物非神經(jīng)組織傳代與空斑克隆相結(jié)合的技術(shù)，將12-1-7株病毒在小鼠腹腔傳一代取脾，空斑克隆4次，再經(jīng)小鼠皮下傳1次，取皮下組織，空斑克隆1次，獲得1株弱毒高度穩(wěn)定的毒株，即病毒經(jīng)3周齡小鼠腦內(nèi)連續(xù)傳5代，或經(jīng)乳鼠腦內(nèi)傳1代，鼠腦內(nèi)的病毒毒力為0的結(jié)果，命名為SA14-9-7株[28]。但該株病毒制成活疫苗，經(jīng)兒童接種后抗體應(yīng)答很差，在41名兒童中只有1名的中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，7名由陰性轉(zhuǎn)為可疑[29]。

為提高SA14-9-7株的免疫性，又將病毒通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)免疫器官(脾臟)傳代的技術(shù)。將SA14-9-7株通過(guò)口服途經(jīng)接種地鼠，收脾臟再以同法連續(xù)傳6代，最后經(jīng)空斑克隆2次，獲得1株毒力和弱毒穩(wěn)定性與SA14-9-7株相同，而免疫原性(小鼠免疫后的保護(hù)力和免疫后中和抗體水平)顯著提高的病毒株，命名為SA14-5-3株[29]。

SA14-5-3的人體免疫后抗體應(yīng)答觀察結(jié)果，顯示其免疫性有顯著提高，如山東濟(jì)南的結(jié)果陽(yáng)轉(zhuǎn)率為86.2%(25/29)[29]，在其他乙腦流行區(qū)為85% ～92%[30]，但在非乙腦地方病區(qū)如浙江象山縣壇頭山島的陽(yáng)轉(zhuǎn)率僅為55% ～77.6%[31]，黑龍江齊齊哈爾市僅為62%[32]。表明其免疫性仍有待提高。另外SA14-5-3株在豬體內(nèi)進(jìn)行過(guò)大量安全性和免疫性觀察表明對(duì)豬的免疫是安全的，并有預(yù)防豬感染乙腦引起流產(chǎn)和死胎的免疫效果。弱毒株穩(wěn)定不易返祖如通過(guò)乳豬皮下傳5代后，其血清、脾臟和皮下組織內(nèi)的病毒，對(duì)小鼠腦內(nèi)接種仍無(wú)致病性[33]。SA14-5-3株雖然沒(méi)有應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn)，但其大量的人體安全性免疫性觀察為以后SA14-14-2株提供臨床應(yīng)用依據(jù)。

為進(jìn)一步提高SA14-5-3株的免疫性，又采用上述相似的技術(shù)，但傳代途經(jīng)改為前述乳鼠皮下傳代的方法，最后篩選到1株毒力最低，免疫力最高的第14-2號(hào)空斑病毒，命名為SA14-14-2作為疫苗制備用候選株[34]。以上從SA14-9-3株開(kāi)始至SA14-14-2株共計(jì)通過(guò)14次空斑克隆，從100多個(gè)病毒空斑中篩選而獲得，篩選過(guò)程中基本根據(jù)以下三項(xiàng)指標(biāo):1.對(duì)2.5周齡小白鼠腦內(nèi)接種不致病，腦組織病理變化顯著減弱，僅個(gè)別神經(jīng)細(xì)胞壞死。2.幼鼠或乳鼠腦內(nèi)傳代1～3代后，毒力無(wú)返強(qiáng)。3.以免疫動(dòng)物1針后誘生中和抗體(＞10)并對(duì)乙腦野毒株共攻擊具有顯著保護(hù)力(90%以上)。

乙腦病毒是嗜神經(jīng)毒力很強(qiáng)的病毒，以10-7很小劑量病毒液腦內(nèi)接種小鼠或猴就能引起動(dòng)物發(fā)生腦炎死亡，要把乙腦病毒毒力減弱至對(duì)以上動(dòng)物腦內(nèi)接種不致病其難度極大。20世紀(jì)50～60年代美國(guó)、日本、前蘇聯(lián)曾進(jìn)行過(guò)多年的研究，但均未能達(dá)到這種水平，特別是要達(dá)到減毒株病毒通過(guò)乙腦病毒敏感動(dòng)物腦內(nèi)返回傳代，而毒力未回升返祖則更難。SA14-14-2疫苗的成功經(jīng)驗(yàn)，是早期采用與傳統(tǒng)(32℃ ～34℃)不同的常溫(37℃)下培養(yǎng)細(xì)胞傳代減毒，當(dāng)弱毒毒力容易恢復(fù)返祖時(shí)采用與傳統(tǒng)(體外細(xì)胞長(zhǎng)期傳代)不同的體外細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)非神經(jīng)組織交替?zhèn)鞔鷾p毒的手段，并在毒力減弱而免疫性降低后采用體內(nèi)免疫組織內(nèi)傳代增加弱毒繁殖能力提高免疫應(yīng)答的手段。同時(shí)在減毒過(guò)程中不斷進(jìn)行多次的空斑克隆篩選。特別是發(fā)現(xiàn)弱毒在體內(nèi)免疫組織傳代有進(jìn)一步降低毒力，提高弱毒穩(wěn)定性的作用，以上SA14-14-2株的減毒成功經(jīng)驗(yàn)具有獨(dú)特的創(chuàng)新性。

2.2.1.2 SA14-14-2株的表型和基因分子特征[35-36]:病毒對(duì)2.5周齡小鼠腦內(nèi)、皮下、腹腔接種均無(wú)致病性，對(duì)地鼠、恒河猴腦內(nèi)接種或裸鼠皮下接種均無(wú)致病性。弱毒穩(wěn)定，經(jīng)3周齡小鼠腦內(nèi)傳5代或乳鼠腦內(nèi)1代，弱毒穩(wěn)定未返祖[37-38]。

對(duì)SA14-14-2弱毒株的基因分析表明，強(qiáng)毒株SA14和減毒株SA14-14-2基因組長(zhǎng)度均為10 976個(gè)核苷酸，兩者存在57～66個(gè)核苷酸差異，導(dǎo)致24～31個(gè)氨基酸發(fā)生改變。其中以外膜蛋白E區(qū)氨基酸突變率最高，有8個(gè)氨基酸發(fā)生突變，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該突變與毒力減弱密切相關(guān)[39-40]。以后通過(guò)乳鼠腦內(nèi)傳1～3代后進(jìn)行傳代前后的病毒全基因序列分析比較，發(fā)現(xiàn)E區(qū)的E107和E138氨基酸與毒力減弱最為密切，這2個(gè)位點(diǎn)氨基酸恢復(fù)突變，則神經(jīng)毒力很快回升[41]。證實(shí)SA14-14-2株的遺傳穩(wěn)定性很高，通過(guò)乳鼠腦內(nèi)傳1代其病毒的基因全序列和弱毒特征未發(fā)生回復(fù)突變[41]，實(shí)驗(yàn)表明在地鼠腎細(xì)胞傳22代的晚代病毒與原始病毒的全長(zhǎng)核苷酸僅發(fā)生8處變化，導(dǎo)致4處氨基酸改變，但均非回復(fù)突變，其核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.30%和99.88%，其中E區(qū)8個(gè)關(guān)鍵氨基酸均未發(fā)生突變[42]。另外，將病毒經(jīng)乙腦病毒主要媒介三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊口腔感染，病毒在蚊體內(nèi)復(fù)制受限，如經(jīng)胸腔感染，則病毒雖然復(fù)制，但復(fù)制能力較SA14母株低，子代病毒對(duì)小鼠腦內(nèi)仍無(wú)致病性，E區(qū)8個(gè)重要氨基酸未發(fā)生突變，表明減毒株病毒無(wú)通過(guò)蚊蟲傳播的能力[43-45]。

對(duì)病毒的免疫原性研究發(fā)現(xiàn)，SA14-14-2株病毒免疫后的一些動(dòng)物雖然中和抗體很低或陰性，但對(duì)野毒株的攻擊保護(hù)很強(qiáng)，與滅活疫苗明顯不同[46]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其與SA14-14-2免疫動(dòng)物后產(chǎn)生很強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答和非結(jié)構(gòu)蛋白中NS1的免疫作用有關(guān)[47-49]。SA14-14-2株疫苗產(chǎn)生較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，最近也在人體觀察中得到證實(shí)[50-51]，并且發(fā)現(xiàn)疫苗免疫后產(chǎn)生的T細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)登革熱病毒有交叉反應(yīng)，提示有可能研發(fā)1種對(duì)乙腦和登革熱兩種疾病均有效的新一代疫苗[50]。另外SA14-14-2株疫苗免疫小鼠后對(duì)當(dāng)前國(guó)內(nèi)流行的Ⅰ、III型基因病毒均有顯著保護(hù)(80% ～100%)[52]。

2.2.1.3 SA14-14-2株臨床安全性和免疫性

SA14-14-2株制備的活疫苗在齊齊哈爾市非乙腦流行區(qū)進(jìn)行小量人體觀察并與SA14-5-3株對(duì)比，結(jié)果前者的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為92.3%，后者為61.5%[32]，以后又在張家口市進(jìn)行觀察，結(jié)果抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為100%[53]，證實(shí)了SA14-14-2株的高免疫原性，優(yōu)于SA14-5-3株。疫苗又經(jīng)50萬(wàn)的臨床觀察[54]，證明安全有效后，取得生產(chǎn)文號(hào)，由成都生物制品研究所正式投產(chǎn)。

上市后的疫苗在國(guó)內(nèi)外進(jìn)行多次大量的安全性和免疫觀察，表明疫苗十分安全，未發(fā)生與疫苗病毒引起的腦炎病例，中和抗體的陽(yáng)轉(zhuǎn)率在91% ～95%[55]，保護(hù)效果93% ～94.5%[56-57]，持久性在國(guó)內(nèi)觀察結(jié)果至少11年[58]，在國(guó)外觀察結(jié)果至少5年[59]。已得到國(guó)際普遍認(rèn)可，是一種高度安全有效的新一代疫苗。

尼泊爾2004—2014年疫苗大規(guī)模應(yīng)用的10年效果觀察顯示，免疫后10年較免疫前當(dāng)?shù)匾夷X減少3 011例，急性腦炎綜合癥減少9 497例[60]。美國(guó)學(xué)者對(duì)SA14-14-2株疫苗于1995年和2015年間，在亞洲不同國(guó)家的16次臨床資料總結(jié)進(jìn)行了綜合回顧，得出的結(jié)論是，自1988年以來(lái)已在全球發(fā)出了7億劑SA14-14-2疫苗，乙腦減毒活疫苗對(duì)大范圍年齡人群均有良好的耐受性，并且在八周嬰兒接種也是安全的，根據(jù)現(xiàn)在資料，獨(dú)立專家(independent expert)們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)接種乙腦活疫苗后報(bào)告的嚴(yán)重不良反應(yīng)與疫苗有關(guān)的足夠證據(jù)[61]。疫苗在全球大規(guī)模應(yīng)用后沒(méi)有發(fā)生與疫苗有關(guān)的確實(shí)證據(jù)也得到WHO認(rèn)可[62-63]。

目前疫苗在國(guó)內(nèi)已納入擴(kuò)大免疫規(guī)劃用制品廣泛應(yīng)用，2013年由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)的乙腦活疫苗為我國(guó)首個(gè)疫苗產(chǎn)品通過(guò)WHO預(yù)認(rèn)證[64]，在美國(guó)適宜衛(wèi)生科技組織(PATH)和GAVI聯(lián)盟的支持下已大量出口到國(guó)外應(yīng)用，目前已有尼泊爾、印度等10多國(guó)進(jìn)口該疫苗[65]，年出口量約5千萬(wàn)人份。

此外，SA14-14-2株也在中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部所屬多個(gè)生物藥業(yè)公司用于制備豬乙型腦炎活疫苗，在國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用于預(yù)防豬感染乙腦病毒引起的流產(chǎn)、死胎和睪丸炎[66]。

2.2.2 SA14-2-8株[67]:2-8株對(duì)乳鼠的腦內(nèi)致死力平均75%，對(duì)3周齡小鼠腦內(nèi)毒力僅個(gè)別發(fā)病致死。但2-8株的免疫原性有很大提高，保護(hù)指數(shù)高達(dá)7.33lg，并對(duì)豚鼠、家兔、地鼠免疫后產(chǎn)生較高的中和抗體。2-8株經(jīng)16只的猴體實(shí)驗(yàn)，腦內(nèi)注射后只有6只發(fā)生很低的發(fā)燒，病理變化所有猴均有不同程度的炎癥反應(yīng)，神經(jīng)細(xì)胞壞死雖輕，但4/16-9/16猴在不同部位有病變。疫苗曾接種過(guò)8 000名兒童，但抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率僅約50%，未繼續(xù)進(jìn)行臨床研究。但2-8株疫苗在馬匹體內(nèi)進(jìn)行過(guò)安全性的免疫性觀察[68]。皮下或肌內(nèi)注射465匹馬，未見(jiàn)體溫反應(yīng)及任何神經(jīng)系統(tǒng)病狀。中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率84.9～86.6%，免疫后對(duì)馬匹乙腦感染的保護(hù)作用，在重流行區(qū)進(jìn)行過(guò)觀察，疫苗注射組13 246匹，發(fā)病4匹，發(fā)病率30.2/10萬(wàn)；未注射組(對(duì)照組)10 081匹，發(fā)病32匹，發(fā)病率317.4/10萬(wàn)，保護(hù)率為90.49%[68]。

2.2.3 H84SP12和L51P11株:林海祥等[69]用空斑克隆技術(shù)，以3周齡小鼠皮下毒力(LD50)高低為篩選指標(biāo)，直接從SA14株乙腦病毒中。通過(guò)3次克隆純化，分離到1株皮下低毒力(LD502.67lg)病毒株，稱L株和1株皮下高毒力(LD50，6.5lg)株，稱H株。2株病毒在小鼠的皮下繁殖力H株顯著高于L株。

將2株病毒分別以快速(18 h)傳代法在地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)連續(xù)傳代，結(jié)果病毒對(duì)幼鼠的皮下毒力，L株下降很快，腦內(nèi)毒力亦有一定下降，但不夠顯著，與傳代前病毒的毒力比較約下降2.0～3.0lg LD50。為進(jìn)一步減毒和提高免疫性，將H株84代病毒按上述SA14-5-3株的乳鼠皮下傳代法傳1代(H84S1)，結(jié)果病毒的腦內(nèi)毒力顯示進(jìn)一步減弱，細(xì)胞和LD50的滴度差值為3.5lg，大于傳代前的1.17差值。

用L51代病毒以小鼠腦內(nèi)低毒力為指標(biāo)，通過(guò)空斑連續(xù)純化7次，各次病毒空斑均出現(xiàn)高低不同的空斑病毒。但逐次出現(xiàn)低毒力病毒比例占多數(shù)的傾向，最后獲得的弱毒株命名為L(zhǎng)51P11。同法將H84S1株通過(guò)空斑連續(xù)克隆挑選8次，同樣出現(xiàn)隨著空斑次數(shù)的增多，低毒力病毒出現(xiàn)的比例增多的傾向，最后在第8次病毒空斑中挑選到一株腦內(nèi)僅個(gè)別小鼠致死的空斑病毒，又經(jīng)過(guò)4次空斑純化后，將該弱毒株命名為H84SP12。2株病毒的免疫性繼續(xù)了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)比較，實(shí)驗(yàn)均顯示H84SP12株的保護(hù)力強(qiáng)于LI51P11株，即前者保護(hù)50%小鼠存活的最小免疫劑量小于后者100倍以上。表明H84SP12株雖然腦內(nèi)毒力與L51P11株相似，但免疫性明顯優(yōu)于后者，提示預(yù)先篩選皮下毒力高，繁殖力強(qiáng)的病毒株，以及再通過(guò)乳鼠皮下傳代提高病毒在體內(nèi)的繁殖力，有助于及時(shí)選育到毒力低免疫力強(qiáng)的減毒株，避免在傳統(tǒng)的傳代減毒過(guò)程中經(jīng)常遇到的毒力減弱后免疫性也減弱或丟失的缺陷，有其獨(dú)特的創(chuàng)新技術(shù)。另外本研究中快速的傳代減毒技術(shù)亦具有一定的創(chuàng)新性。

2.2.4 雞5-3株:王用揖等[70]用以上述SA14-5-3減毒株為毒種，經(jīng)雞胚細(xì)胞和地鼠腎細(xì)胞交替?zhèn)鞔?次后，在雞胚細(xì)胞培養(yǎng)上空斑克隆1次，再經(jīng)雞胚卵黃囊接種，取胚傳下代，連續(xù)傳25代，病毒滴度達(dá)6.0lg TCID50。以25代后的雞胚病毒制成凍干疫苗進(jìn)行馬匹免疫實(shí)驗(yàn)。馬匹于頸部肌內(nèi)注射2.0 ml疫苗，免疫后1個(gè)月內(nèi)，未見(jiàn)體溫上升亦無(wú)不良反應(yīng)，接種后5～7 d產(chǎn)生病毒血癥，中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率免后1個(gè)月73.6%(強(qiáng)陽(yáng)轉(zhuǎn)率)和94.7%(弱陽(yáng)轉(zhuǎn)率)。疫苗免疫馬匹后，用乙腦強(qiáng)毒株感染攻擊，結(jié)果未免疫馬經(jīng)強(qiáng)毒株攻擊后出現(xiàn)臨床癥狀和病毒血癥，免疫馬未出現(xiàn)癥狀和病毒血癥，表明雞5-3株具有保護(hù)乙腦野毒株感染的保護(hù)作用。

2.2.5 SA14-14-2:PCK株[71]:中國(guó)食品藥品檢定研究院與美國(guó)泛特里軍事醫(yī)學(xué)研究所WRAIR合作，將乙腦SA14-14-2減毒株早代病毒在原代狗腎細(xì)胞(液氮凍存的細(xì)胞)連續(xù)傳代，病毒滴度在第6代時(shí)達(dá)高峰(7.0×106lg PFU/ml)。繼續(xù)傳至16代滴度未繼續(xù)升高，用第7、8、9代病毒分別制成主毒株，生產(chǎn)毒種和疫苗，各代病毒均對(duì)2～3周齡ICR小鼠腦內(nèi)接種無(wú)致病性，以生產(chǎn)毒種病毒接種10只恒河猴和SA14母株2只猴對(duì)比作神經(jīng)毒力實(shí)驗(yàn)，每只猴于脊髓和大腦兩側(cè)各接種1劑量病毒液或稀釋液，結(jié)果生產(chǎn)毒種組和稀釋液組猴均未出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，SA14 2只均出現(xiàn)上下肢麻痹癥狀。病理變化分三級(jí)判定，結(jié)果生產(chǎn)種猴的病理未出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞壞死，均為V1級(jí)的輕度病變，而SA14乙腦強(qiáng)毒株病毒則出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞退變和壞死，V2占絕大多數(shù)，少數(shù)為V1和V3級(jí)。

后期WRAIR將毒種轉(zhuǎn)讓Intercel Biomedical用Vero細(xì)胞生產(chǎn)滅活的乙腦疫苗，已經(jīng)美國(guó)批準(zhǔn)臨床應(yīng)用，并已在全球很多國(guó)家推廣應(yīng)用[72]。

2.2.6 SA14-14-2PDK-CD株:王壽貴等[73]將SA14-14-2株第5代毒種適應(yīng)小獅子狗胎腎原代細(xì)胞(PDK)。發(fā)現(xiàn)病毒能很快適應(yīng)PDK細(xì)胞，從第4代至11代病毒滴度穩(wěn)定在7.5～8.0 lg TCID50，并對(duì)12-14 g小鼠腦內(nèi)接種均無(wú)致死，通過(guò)乳鼠腦回傳一代后對(duì)幼鼠的腦內(nèi)毒力仍很低，在0.5～1.67 lg LD50。表明其毒力高度減弱而且穩(wěn)定不易返祖。

以SA14-14-2PDK-CD株制備的活疫苗在甘肅省武威市非乙腦流行區(qū)進(jìn)行兒童和成人接種觀察，同時(shí)與SA14-14-2 HK株活苗進(jìn)行比較[74]。結(jié)果兩組疫苗接種者均未發(fā)現(xiàn)疫苗引起的不良反應(yīng)。23名接種前抗體陰性兒童接種1針后的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為92.9%，25名抗體陰性兒童接種SA14-14-2 HK株的95.7%相似。顯示SA14-14-2 PDK-CD株的毒力低穩(wěn)定而且有良好的免疫原性，具有發(fā)展1種以原代狗腎細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)的乙腦減毒活疫苗的前景。

3 結(jié)語(yǔ)

1949年初期，中國(guó)乙腦嚴(yán)重流行，年死亡人數(shù)高達(dá)數(shù)萬(wàn)至10多萬(wàn)。老一輩科學(xué)家包括黃禎祥、汪美先、王逸民、李河民、王用揖、自登云等從自然界分離到數(shù)百株乙腦病毒，進(jìn)行生物學(xué)、抗原性、免疫性以及細(xì)胞培養(yǎng)特征和毒力變異的研究，發(fā)現(xiàn)自然界乙腦毒株間存在毒力的明顯差異，特別是神經(jīng)外毒力差異更為顯著，并且發(fā)現(xiàn)同一病毒株內(nèi)存在不同毒力的病毒顆粒，通過(guò)空斑純化能夠加以分離，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)毒力強(qiáng)弱與病毒在體內(nèi)各臟器的復(fù)制強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間和病毒血癥有關(guān)。另外通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞的培養(yǎng)傳代可以人工誘導(dǎo)病毒的毒力變異。結(jié)合乙腦在自然界的流行和傳播規(guī)律的研究闡明毒力變異的原因取決于環(huán)境的壓力，即與媒介昆蟲、動(dòng)物宿主和自然環(huán)境等因素密切相關(guān)。同時(shí)也闡明人體乙腦隱性和顯性感染的原因。研究結(jié)果為以后中國(guó)乙腦的防控以及滅活疫苗和減毒疫苗的研制和實(shí)際應(yīng)用提供重要的科學(xué)數(shù)據(jù)。

在病毒的毒力變異、減毒和減毒活疫苗研究上，中國(guó)學(xué)者作了大量的研究工作，獲得多株減毒株，已成功制成疫苗應(yīng)用人體、豬體和馬匹，對(duì)我國(guó)在人和動(dòng)物中乙腦流行的控制起到重要作用。雖然一些減毒株未能達(dá)到制備人體減毒活疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但在病毒的培養(yǎng)特征、變異規(guī)律、減毒技術(shù)、減毒指標(biāo)和檢測(cè)技術(shù)及質(zhì)量控制上取得值得借鑒的豐富經(jīng)驗(yàn)。其中特別是發(fā)現(xiàn)病毒通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的非神經(jīng)組織傳代，能夠進(jìn)一步降低病毒的殘余毒力并提高其免疫性，應(yīng)用該創(chuàng)新性技術(shù)成功篩選到1株高度減毒而穩(wěn)定并保持高免疫性的SA14-14-2株。用其制成的減毒活疫苗，達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平，得到WHO的認(rèn)可，生產(chǎn)的疫苗取得了WHO的預(yù)認(rèn)證，已在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用。將對(duì)全球的乙腦控制，降低死亡和殘疾人數(shù)起到重要作用。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心專家們指出[76]，當(dāng)前有幾種乙腦疫苗可供選擇，特別是乙腦SA14-14-2株疫苗的質(zhì)量得到WHO認(rèn)可，已取得WHO預(yù)認(rèn)證，質(zhì)量可靠，價(jià)格合理，同時(shí)得到GAVI財(cái)政上的支持，因此全球控制乙腦疫苗的時(shí)機(jī)比以往任何時(shí)期更佳。通過(guò)國(guó)際社會(huì)和中國(guó)政府的支持與努力，我們有機(jī)會(huì)拯救和改善數(shù)以百萬(wàn)計(jì)兒童的生命和生活。

以上不同減毒株的選育經(jīng)驗(yàn)，特別是SA14-14-2株通過(guò)獨(dú)特的減毒技術(shù)，獲得一株病毒毒力高度減弱，遺傳穩(wěn)定性良好，同時(shí)保持高免疫原性的減毒活疫苗株的經(jīng)驗(yàn)。將為研發(fā)其他蟲媒病毒病的減毒活疫苗提供重要科學(xué)依據(jù)。

利益沖突無(wú)