燈盞花乙素防治缺血性心腦血管疾病的分子機制研究進展

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腦梗死和心肌梗死是常見的缺血性心腦血管疾病(ischemic cardiovascular and cerebrovascular disease，ICCVD)，世界十大致死疾病排名，ICCVD居各種疾病死因第一位[1]。臨床ICCVD的治療一般是：急性期溶栓及介入治療；亞急性期神經(jīng)保護劑應用；恢復期各類康復治療。由于ICCVD涉及多通路、多靶點及ICCVD后遺癥，極大地限制一般治療方法的應用。因此從天然產(chǎn)物中尋找具有抗心肌細胞和腦細胞缺血、缺氧的活性物質，是治療ICCVD的主要方法。

燈盞花乙素(scutellarin，SCU)即4，5，6-三羥基黃酮-7-葡糖醛酸苷，是從中國傳統(tǒng)中藥燈盞細辛中提取的一種黃酮，占燈盞花素含量90%以上[2]。SCU通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子、增加蛋白激酶G(PKG)活性、拮抗氧化應激、抑制興奮性氨基酸產(chǎn)生、抑制炎性介質釋放、抑制促凋亡因子、調節(jié)Ca2+通道、拮抗細胞凋亡、保護內(nèi)皮細胞等多靶點防治ICCVD。

1 釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子

神經(jīng)營養(yǎng)因子(secreting neurotrophic factors，NTFs)是一類由神經(jīng)支配的組織(如肌肉)和星形膠質細胞產(chǎn)生的，神經(jīng)元生長與存活所必需的蛋白質分子。其中神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)對神經(jīng)元生長、發(fā)育和功能完整性有重要作用。NGF能增加腦血流量、減少梗死體積和改善缺氧損傷導致的神經(jīng)功能障礙[3]。BDNF對神經(jīng)元的發(fā)育分化與生長再生具有維持和促進作用[4]。通過抑制小膠質細胞和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，保護多巴胺能神經(jīng)[5]。

Chai等[6]通過腦中動脈缺血(MCAO)模型發(fā)現(xiàn)，給予SCU后，星型膠質細胞mRNA和蛋白質中NGF、BDNF及GDNF因激活p-CREB和p-Akt信號通路，使其表達增加，拮抗缺血性腦損傷。Moosavi等[7]研究表明，釋放NGF和BDNF是SCU在體內(nèi)外發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用的關鍵。

2 對蛋白激酶的影響

蛋白激酶B(PKB)在細胞存活和凋亡中起重要作用，又稱Akt。Chai等[6]表明，因激活星型膠質細胞的PKB信號通路增加其蛋白質中NGF、BDNF及GDNF的表達，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。這與Moosavi等[7]研究結果一致。

蛋白激酶C(PKC)有11種亞型，在細胞的生長、分化、細胞代謝及轉錄激活等方面發(fā)揮重要作用。Xu等[8]將未分化的嗜鉻細胞瘤PC12細胞進行缺血缺氧處理作為體外缺血缺氧再灌注模型，給予SCU，結果表明SCU抑制PKC活性，減少對PC12細胞的損傷。SCU可抑制糖尿病綜合征鼠胸主動脈PKCβ1、PKCβ2、和PKCδ易位，治療糖尿病[9]。

Chen等[10]通過缺氧-再給氧(HR)誘導冠狀動脈內(nèi)皮損傷表明，SCU激活PKG，作用于其底物血管擴張刺激群蛋白(VASP)，VASP產(chǎn)生磷酸化作用，生成pVASP，保護血管內(nèi)皮細胞。Li等[11]分別以不同濃度SCU給予(45 mg/kg和90 mg/kg，靜脈注射)缺血缺氧再灌注(MIR)損傷鼠和HR誘導損傷的人心臟微血管內(nèi)皮細胞(HCMECs)(1 μmol/L和10 μmol/L)，其中VASP在Ser239位點的磷酸化作用(pVASP)與VASP比值反映PKG活性。給予SCU 2 h后結果發(fā)現(xiàn)，SCU增加PKG活性，且呈劑量依賴性減少梗死面積和恢復離體冠狀動脈環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張功能。其機制是SCU激活靶點PKG1-a在Ser50、Ser72、Ser89、Ser44和Thr58位點的磷酸化作用，拮抗MIR損傷和HR誘導內(nèi)皮損傷導致的細胞凋亡。這與Liu等[12]結果一致。Du等[13]研究SCU對內(nèi)皮細胞功能的保護作用時也應用體內(nèi)外模型，體外與Li等[11]采用的模型一致，但體內(nèi)采用的是腦缺血再灌損傷(CIR)鼠。將人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMECs)缺氧12 h，再給氧12 h后分為5組：對照組、HR模型組、HR+SCU 0.1 μmol/L組、HR+SCU 1μmol/L組、HR+SCU 10μmol/L組，給予SCU 2 h后發(fā)現(xiàn)，SCU呈劑量依賴性地增加pVASP、VASP表達和PKG-Ⅰ的活性。SCU減少腦梗死面積和恢復離體基底動脈環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張功能。拮抗CIR損傷和HR誘導內(nèi)皮損傷導致的細胞凋亡。Zhang等[14]研究證實SCU拮抗腦血管內(nèi)皮功能障礙是通過激活PKG信號通路。

p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)是一種應激激活蛋白，被一些促炎因子如轉化生長因子(TGF)α、白介素-1(IL-1)等應激激活。細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化后抗凋亡，同時激活轉錄因子，以刺激表達存活相關基因產(chǎn)生抗凋亡作用。結扎大鼠冠狀動脈8周造成間質纖維化和心功能不全，腹腔注射SCU后應用PCR和Western blot技術檢測，發(fā)現(xiàn)TGFβ、p38-MAPK的表達被抑制，ERK1/2表達增加，起到了保護作用[15]。

3 拮抗氧化應激

ICCVD使活性氧(ROS)的產(chǎn)生遠強于清除能力，造成ROS過度蓄積及脂質過氧化反應產(chǎn)生代謝物丙二醛(MDA)等均致使大量自由基產(chǎn)生，降低超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)活性，加重心肌梗死、腦梗死再灌損傷。Hu等[16]建立MCAO模型鼠，經(jīng)SCU預處理7 d，Western blotting檢測eNOS表達上調，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)表達下調，大鼠梗死體積明顯減少。Liu等[17]通過H2O2誘導模擬神經(jīng)損傷，表明SCU可減少cNOS表達，從而減少神經(jīng)損傷。通過喂養(yǎng)高脂飼料誘導形成高脂血癥鼠，給予SCU后發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞eNOS增加，提高乙酰膽堿誘導的內(nèi)皮依賴性血管舒張活性，起到抗高脂血癥的作用[18]。有研究觀察SCU拮抗氧化應激導致的細胞凋亡作用，將PC12細胞暴露于H2O2環(huán)境中，激活氧化應激，ROS和MDA過度表達，脂質過氧化，用SCU預處理后可逆轉，保護細胞[19]。與Hong等[20]之前用H2O2處理SCU孵育過的PC12細胞結果一致，且SCU較抗氧劑VitE效價高。Guo等[21]研究表明，SCU可增加SOD，降低MDA產(chǎn)生，拮抗氧化應激，減少Aβ蛋白產(chǎn)生導致的神經(jīng)毒性。Guo等[22]通過MCAO誘導大鼠缺血缺氧后給予SCU，結果說明SCU可拮抗因缺血性腦損傷導致的SOD、CAT和GSH下降，減少ROS產(chǎn)生，降低腦梗死體積，保護內(nèi)皮細胞，起到神經(jīng)保護作用。這與Yang等[23]研究結果一致，SCU降低肝組織MDA水平(P<0.05)及血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、黃嘌呤氧化酶(XOD)活性(P<0.01)，升高SOD(P<0.05)和谷胱甘肽過氧化物(GSH-PX)(P<0.01)水平，拮抗因腦缺血再灌注損傷引起的肝損傷。

4 抑制興奮性氨基酸產(chǎn)生

興奮性氨基酸(EAA)谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、海仁藻氨酸(KA)、喹啉酸等，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)介質。在ICCVD等病理生理條件下，EAA受體過度激活，造成神經(jīng)損傷，產(chǎn)生“興奮毒性”。SCU可抑制離子型谷氨酸受體表達，阻止神經(jīng)元凋亡[24]。結扎雙側頸總動脈大鼠給予SCU結果表明，SCU抑制Glu、Asp、氨基丁酸(GABA)表達，拮抗缺血再灌損傷[25]。

5 抑制炎性介質釋放

核轉錄因子κB(NF-κB)為一個轉錄因子蛋白家族，包括5個亞單位：Rel(cRel)、p65(RelA，NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。不需要翻譯新的蛋白進行調控，可與特異性κB序列結合后誘導相關基因轉錄。Chen等[26]研究發(fā)現(xiàn)SCU顯著減少NF-κB，阻斷炎性應答，抗高血壓。Yuan等[27]研究表明，SCU通過抑制MCAO模型鼠和小神經(jīng)膠質細胞NF-κB，抑制炎癥反應，拮抗缺血損傷。Wang等[28]研究SCU的神經(jīng)保護機制，尤其是小膠質細胞的抗炎作用，顯示由于SCU抑制脂多糖誘導產(chǎn)生的炎性介質，如NO、腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-1β、ROS，抑制脂多糖誘導產(chǎn)生的核易位和DNA與NF-κB結合的活性。表明SCU可治療小膠質細胞介導的不同神經(jīng)炎癥。

永久性MCAO實驗發(fā)現(xiàn)，SCU可抑制缺血腦區(qū)炎性介質TNF-α、IL-6和IL-1β及血管緊張素轉化酶(ACE)的釋放，增加血流量，拮抗缺血導致的炎癥反應[29]。Luo等[30]研究SCU對高糖誘導的血管炎性保護作用時，應用人內(nèi)皮細胞ECV304給予高糖誘導后，給予SCU預處理，結果顯示SCU呈濃度依賴性(0.1 mmol/L～1 mmol/L)減少細胞間黏附分子1(ICAM-1)和單核細胞趨化蛋白(MCP-1)含量，發(fā)揮抗血管炎癥作用。

6 抑制促凋亡因子

IL-1β、IL-6 、TNF-α、Caspases3等均為促凋亡因子。Guo等[31]將Wistar鼠隨機分成對照組、Aβ組(給予Aβ蛋白誘導為HR)、Aβ+SCU組，結果Aβ組IL-1β、IL-6、TNF-α表達增加，Aβ+SCU組下降，表明SCU可抑制促凋亡因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達，從而抑制炎癥反應與細胞凋亡，與Wang等[29]研究結果一致。Chen等[26]證實SCU可抑制TNF-α、IL-1β、IL-18、Bax和Caspases3表達，阻斷炎性應答反應，抗高血壓。將出生3 d的新生鼠建立心肌缺血損傷模型及取其心室組織細胞結果均為SCU抑制細胞色素C(CytC)的釋放和Caspases3的活性，拮抗缺血性心肌細胞凋亡。Li等[32]取新生SD鼠心肌細胞原代培養(yǎng)4 d后分為5組：對照組、心肌缺氧組、心肌缺氧給予高、中、低SCU處理組，發(fā)現(xiàn)SCU通過下調促凋亡基因Bax，上調抑制凋亡基因Bcl-2表達，保護心肌細胞。

7 調節(jié)Ca2+通道

Ca2+通道在神經(jīng)元的不同部位表達不同。神經(jīng)元胞膜鈣離子通道有電壓依賴性通道(Cav)、配體操縱性通道。其中Cav有L、N、P、Q、R、T 6種亞型。配體操縱性通道有兩大類：Glu依賴性通道和非Glu依賴性通道。在神經(jīng)元內(nèi)鈣離子通道也分兩大類：IP3R和阿若堿受體(ryanodine)敏感的鈣離子通道。ryanodine敏感的鈣離子通道其有RYR1、RYR2、RYR3三個亞型，其中腦內(nèi)主要為RYR3。Liu等[33]研究表明，SCU抑制Ca2+內(nèi)流，上調鈉-鉀交換三磷酸腺苷酶的活性，拮抗氧化應激，發(fā)揮保護效應。Pan等[34]在研究SCU對心臟肥大的作用及機制時，用激光掃描共聚焦顯微技術在體內(nèi)體外發(fā)現(xiàn)，SCU通過抑制細胞外Ca2+內(nèi)流，阻斷Ca2+下游效應器鈣神經(jīng)素和磷酸化鈣調蛋白激酶2(CaMKⅡ)通路，拮抗心臟肥大。Pan等[35]研究SCU舒張血管機制時，將大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞分為完整型與損傷型，給予不同濃度(3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L)SCU，發(fā)現(xiàn)SCU呈劑量依賴性抑制神經(jīng)元胞膜的電壓依賴性Ca2+通道，抑制細胞外Ca2+內(nèi)流，擴張Ca2+誘導收縮的血管，保護內(nèi)皮細胞。Zhu等[36]研究結果顯示，SCU能阻斷心肌肌質網(wǎng)鈣轉運，阻斷電壓依賴性Ca2+通道開放，保護心肌平滑肌細胞。

8 拮抗細胞凋亡

SCU通過拮抗神經(jīng)干細胞凋亡，減弱多發(fā)性硬化導致的運動缺陷[37]。Zhang等[38]研究大鼠瞬時腦缺血，表明SCU抑制聚ADP核糖聚合酶(PARP)依賴的線粒體功能障礙的過度活化和細胞凋亡誘導因子(AIF)核易位，拮抗神經(jīng)細胞凋亡。Ghosh等[39]研究表明SCU具有拮抗神經(jīng)元凋亡、抗氧化等作用。

9 保護內(nèi)皮細胞

血管內(nèi)皮細胞(VEC)位于血液與血管組織之間，它不僅能完成血液和組織液的代謝交換，而且合成和分泌多種生物活性物質，保證血管正常的收縮和舒張，維持血管張力，調節(jié)血壓及凝血與抗凝平衡等特殊功能，進而保持血液的正常流動和血管的長期通暢。內(nèi)皮細胞參與早期的缺血再灌注損傷(IR)損傷，對IR損傷較敏感，易造成內(nèi)皮細胞損傷與內(nèi)皮功能障礙。

小鼠胸主動脈環(huán)實驗結果發(fā)現(xiàn)，SCU呈劑量依賴性松弛因去甲腎上腺素刺激引起的胸主動脈收縮作用，松弛作用在去除內(nèi)皮時下降，此作用被一氧化氮合酶抑制劑和可溶性的鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑抑制。CAT抑制劑可增加主動脈的收縮，抑制SCU最低濃度引起的松弛作用。300 μmol/L和1 000 μmol/L SCU可明顯抑制由去氧腎上腺素引起的劑量依賴性收縮，舒張血管。表明SCU舒張血管作用與內(nèi)皮細胞NO信號轉導有關，且具有內(nèi)皮細胞依賴性[40]。Shi等[41]將12 h缺氧(5%CO2+2%O2+93% N2)和12 h的再給氧(5%CO2+95%空氣)處理的心臟微血管內(nèi)皮細胞分為4組：對照組、HR組、SCU+HR組、依達拉奉+HR組。SCU+HR組以SCU(1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)劑量處理2 h，結果SCU可上調核翻譯起始因子(EIF6)表達，保護心內(nèi)皮細胞，SCU通過增加伴侶蛋白HSPD和CCT6A表達，拮抗HR導致的心臟微血管內(nèi)皮損傷。血管生成在生理和病理過程中起著重要作用，參與缺血性心臟病、糖尿病、慢性炎癥和癌癥等疾病。Gao等[42]將SCU給藥至Aβ+人臍靜脈內(nèi)皮細胞上，通過細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，SCU呈劑量依賴性增加金屬基質蛋白酶(MMP)-2誘導血管生成。SCU給藥量為10 μmol/L時，可促進血管增殖、遷移、入侵及形成，發(fā)揮SCU促血管生成作用，治療缺血性心血管疾病。

10 其 他

SCU可上調細胞外信號調節(jié)激酶5(p-Erk5)和人樣轉錄因子2(KLF2)，緩解因蛛網(wǎng)膜下隙出血導致的血管痙攣[43]。EIF6[44]分子量約26 kD，一種參與核糖體亞基生物合成和組裝，進化保守的單體蛋白質，可抑制Bax，調節(jié)細胞生長。SCU可抑制細胞色素P450同工酶1A2(CYP1A2)的代謝[45]。Zhu等[46]研究SCU對絕經(jīng)后綜合征和阿爾茲海默癥神經(jīng)保護作用時發(fā)現(xiàn)，SCU可抑制大鼠體內(nèi)及PC12細胞Aβ蛋白的表達，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

11 小 結

隨著生活水平的提高，壓力的增大，人們患有高血壓、腦血栓等心腦血管疾病的風險也越來越高。天然藥物現(xiàn)代化進程的加快，其有效成分及單體防治缺血性心腦血管疾病已成為研究熱點。SCU可松弛胸主動脈和腹主動脈，減少血管阻力，降低舒張壓[35]，且SCU在20世紀70年代臨床用于防治ICCVD，效果優(yōu)于燈盞花素[26，47]。每日服用 50 mg～200 mg可治療冠狀動脈心臟病，抗心絞痛，拮抗心肌缺血和中風[48-50]。隨著研究日趨增多及現(xiàn)代科學技術發(fā)展，對SCU分子機制和SCU相關信號通路的揭示，為SCU的運用前景提供基礎。