848例結核標本DNA微陣列法檢測探討

李開吾

（鹽城市第二人民醫(yī)院 江蘇 鹽城 224002）

世界范圍內隨著各種因素，特別是環(huán)境因素的不斷改變，全世界的結核預防及控制工作顯得非常緊迫，在新技術、新方法不斷推陳出新的情況下：出現(xiàn)了LAMP、XPERT、以及PCR等系列的方法學，DNA微陣列基因芯片法，在臨床試驗中的應用，得以在我科開展，現(xiàn)就我市的開展情況作如下的探討。

1.材料

（1）所有試劑均為博奧公司提供的成品，同時提供了全套設備包括：擴增儀，雜交恒溫儀，洗滌干燥儀，恒溫振蕩儀，金屬浴，快速提取儀，微量離心機。（2）自備的有4.0%NaOH、N-乙酰-L-半胱氨酸，蒸餾水，生理鹽水，移液器，吸頭，8連排管等。（3）病源標本為我院接收的全市7縣區(qū)的痰檢樣本及羅氏培養(yǎng)菌株，計848例，其中痰樣本769例，菌株79例，年齡段在21至86歲之間，男性596例，女性252例。

2.方法

博奧公司提供的結核分枝桿菌DNA微陣列法的操作流程：

（1）標本準備：按照操作規(guī)程要求，按留取的痰檢后標本，LAMP檢測的標本，XPERT檢測的標本，以及羅氏培養(yǎng)后的菌株標本，鏡檢結果在：2～5條/300HP、1+、2+到4+不等[1]。

（2）液化處理：采用0.5%N-乙酰-L-半胱氨酸的4%NaOH加等量處理液化、振蕩及36℃恒溫箱中放置不同時間，觀察液化狀況，以及后續(xù)加0.5%酚酞指示劑和4%HCL處理等過程。觀察到吸取不粘稠，吸出不成絲，吹出呈點滴狀備用[1]。

（3）提取核酸標本：液化好的標本吸取1ml放入離心管中，12000rpm/分，離心6分鐘，棄去上清液，再加入1ml生理鹽水洗滌振蕩至底物漂浮上來后，離心12000rpm/分，6分鐘，取出，吸取上清液棄去，盡量吸干凈，加入50ul的核酸提取液，菌株直接挑取一個菌落于提取管中，用移液器直接混勻吸入后移至提取管中，蓋好后振蕩10分鐘，放入金屬浴5分鐘裂解，取出離心10000rpm/分，1分鐘備用[3]。

（4）擴增：準備所需檢標本數(shù)的3排8連排管，室溫或36℃ 溫箱中融化酶試劑PCR1.2.3，每管加酶試劑18ul，再加提取液4ul，加蓋后離心瞬間10000rpm/分，打開擴增儀，設置程序，擴增2小時44分，后在擴增儀中95℃變性10分鐘，取出放入冰水混合物中5分鐘備用。

（5）雜交：準備雜交盒及微陣列芯片及8連排管2排，將雜交混合液取出放入室溫回復至復融狀態(tài)，每管加樣9ul，按順序加入擴增DNA模板1+2；1+3液各4ul于相應的8連排管中，混勻備用，點樣，吸取12.5uL分別為rpo B和KatG及inhA DNA模板液于芯片小孔內，然后輕輕振蕩后，加蓋閉合后放入恒溫雜交儀中雜交2小時取出[4]。

（6）洗滌：取出雜交盒，打開取出芯片置于片架上，放入準備好的洗滌儀中清洗，待清洗完后，取出放入干燥儀中干燥5分鐘取出備檢。

（7）判讀結果：打開熒光判讀儀及電腦進入程序，并輸入數(shù)據(jù)及信息，插入芯片，開始檢測，判讀熒光數(shù)值及結果判讀，確定其類型。

3.結果分析

2017年8月26日—2018年5月31日間共檢測848例我市7縣區(qū)的結核臨床、門診標本。①野生型：451例，占53.18%；②雙特變型人數(shù)為61例，為7.19%，單突變數(shù)59例，其中rpoB型31例占3.66%，KatG 或inhA為28例，占3，30%；③TB.DNA＜1000數(shù)為125例，占14.74%；④分枝桿菌數(shù)54例，占6.37%；⑤樣本異常數(shù)（條帶不正常）79例，占9.32%；⑥復檢數(shù)19例，占2.24%；⑦復檢成功8例，占42.11%；總突變數(shù)120例，占14.15%。上述的分布情況即為結核3種基因型微陣列法的檢測情況。

4.討論

通過結核分枝桿菌DNA微陣列法檢測全市此期間的848例標本，初步得出此時間段的我市結核病人的分布情況以及耐藥基因的出現(xiàn)率；同時提供給臨床及時實驗數(shù)據(jù)，指導臨床進行合理的用藥及治療，減少對病人用藥的盲目性，更具臨床針對性，為我市的近期結核預防提供有用的流行病學資料。