ISSR分子標記技術在甜菜育種中的應用

鄒奕 ，馬龍彪 ，2，3，江偉 ，李文晶 ，吳則東 ，2，3*

（1．黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2．中國農業(yè)科學院甜菜研究所/黑龍江大學農作物研究院，哈爾濱 150080；3．中國農業(yè)科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080）

甜菜是許多國家的重要經濟作物，其商業(yè)栽培已延伸至世界上50多個國家。栽培甜菜分為食用甜菜、飼用甜菜、葉用甜菜和糖用甜菜，目前在我國種植面積最大的是糖用甜菜，2014—2016年每年的播種面積13．5萬公頃～14．9萬公頃（據(jù)中國農業(yè)年鑒網(wǎng)）。糖用甜菜是世界上主要的糖料作物，甜菜糖大約占到世界食糖總量的25%。目前我國甜菜發(fā)展主要面臨幾個困境，一是隨著國產新品種的不斷增加和外來品種的引進，品種鑒定難度逐漸增大，僅根據(jù)表型特征區(qū)分品種是困難的，因此建立一套快速鑒定甜菜品種的檢測方法至關重要，而通過DNA分子鑒定方法檢測品種，將節(jié)省大量的時間[1]；二是甜菜病害較為嚴重，常見的甜菜病害包括褐斑病、根腐病、叢根病等，病害的防治主要是依靠化學藥劑，容易引起農藥殘留和環(huán)境污染，長期使用會產生抗藥性，因此，抗病品種的篩選尤為重要；三是國外進口甜菜品種基本占據(jù)了我國甜菜種子市場的95%以上，亟需優(yōu)質國產種子補充市場。

區(qū)間簡單重復（Inter-simple sequence repeat，ISSR）標記技術是基于PCR的一種分子標記技術，該技術通常利用長16～25bp的微衛(wèi)星作為引物，在單引物PCR反應中靶向多個基因座，主要擴增不同大小的SSR間序列。所使用的引物可以是未錨定的、或者通常在3′或5′端錨定1至4個簡并堿基延伸到堿基序列。ISSR技術將AFLP和微衛(wèi)星分析的大部分優(yōu)點與RAPD的普遍性相結合。ISSR具有很高的重復性，可能是由于使用了較長的引物（16～25 mers），與 RAPD 引物（10-mers）相比，可以使用高退火溫度（45～60℃），從而具有更高的嚴格性。研究表明，只有最微弱的譜帶是不可重現(xiàn)的[2]。當使用聚丙烯酰胺檢測時，92%～95%的片段可以在相同栽培品種的DNA樣品上重復[3]。ISSR分子標記自建立以來就已被廣泛用于植物遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構建或品種鑒定等[4]，并在甜菜分子育種上得到了較為廣泛的應用。本文將就ISSR分子標記在甜菜育種上的應用進行綜述，并對ISSR分子標記技術在甜菜上的未來發(fā)展進行展望。

1 ISSR分子標記技術在甜菜育種中的應用

1.1 甜菜的抗病育種

吳旭紅[5]使用ISSR分子標記，對甜菜高抗品種ZD204及其雜種后代的抗病基因進行標記，以達到使用分子標記來輔助抗病育種的早期鑒定并選擇雜種的目的。對KWS9419株系和ZD204的雜交后代采用BSA法和RAPD分析，獲得了和甜菜抗根腐病基因連鎖的RAPD標記0PP084760，然后將其轉變?yōu)镮SSR標記，可以對甜菜雜種的幼苗期抗根腐病基因進行分子標記鑒定。吳旭紅[6]還應用ISSR技術，用80個ISSR引物對兩親本甜菜基因組DNA進行擴增，77．5%的擴增條帶清晰，其中42條在親本間表現(xiàn)出多態(tài)性條帶。引物BA0061在ZD204中擴增出1200bp的多態(tài)性條帶，證明了3個不同遺傳背景的甜菜品種（系）中可以擴增出標記BA0061-1200，已知含有該抗性基因1200bp條帶，而其他3條不含有這個抗性基因沒有擴增產物。這表明標記BA0061-1200更具有特異性，在檢測抗性基因方面具有很大的潛力。利用ISSR標記分析F2群體的抗病性，表現(xiàn)了ISSR標記的可行性和優(yōu)越性。

1.2 開發(fā)SSR引物

牛澤如等[7]使用ISSR標記開發(fā)了甜菜SSR引物。試驗設計思路是以AFLP-PCR和ISSR-PCR為基礎，結合基因組步移，構建基因組文庫，然后擴增兩個微衛(wèi)星之間的序列進行基因組步移，獲得另一端微衛(wèi)星序列。ISSR-PCR定位于SSR區(qū)域，并對含有SSR序列的片段進行進一步靶向選擇，起到了富集微衛(wèi)星片段的作用，這種方法不使用放射性探針標記和繁瑣的雜交，便捷安全，微衛(wèi)星獲得率較高。因為ISSR引物具有通用性，并且有很多不同限制性內切酶可供使用，只要可以設計合適的PCR引物并得到滿足SSR引物設計的片段，就可以得到想要的SSR引物。

1.3 甜菜種質資源和品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建

劉華君等[8]對18份來自德國的甜菜品種和2份來自瑞士的甜菜品種進行遺傳圖譜的構建和聚類分析，從100個ISSR引物中篩選出了7個具有良好多態(tài)性的ISSR引物，使用7個ISSR引物擴增了20個甜菜種質資源，共得到了39個等位變異，每個引物檢測到3～8個等位變異，平均等位變異為5．6個，其中30條多態(tài)性條帶，7 套 ISSR 引物的多態(tài)信息含量（PIC）為 0．6273～0．8360，平均數(shù) 0．7650，20 個供試品種的遺傳相似系數(shù)為0．4615～0．9231，平均數(shù)0．6923。傅增娟[9]首先對甜菜ISSR-PCR反應體系進行了優(yōu)化，確定了合適的反應體系和擴增程序，利用ISSR分子標記技術鑒定了33個甜菜種質資源，僅利用1條引物就鑒別了10份甜菜種質資源。劉巧紅等[10]利用兩條ISSR引物就成功地鑒定了10個不同來源的甜菜品種，遺傳相似系數(shù)為0．43～0．83，平均為 0．62。 Izzatullayeva等人[11-12]利用 ISSR 和 RAPD 對甜菜品種的遺傳多樣性進行評價，其中12條ISSR引物共產生178個條帶，其中173條為多態(tài)性條帶，發(fā)現(xiàn)ISSR引物更加適合甜菜的遺傳多樣性分析。Srivastava等人[13]利用同工酶、RAPD和ISSR共同對甜菜品種進行遺傳多樣性分析。表明ISSR分子標記技術可以有效地進行甜菜品種和資源的指紋圖譜構建以及遺傳多樣性分析。 Amini等人[14]利用ISSR標記分析伊朗甜菜引起根腐病的腐霉菌的遺傳多樣性，從伊朗8個省搜集到的19個腐霉菌的分離純化物，利用8個ISSR引物進行分析，結果表明，8個省的腐霉菌之間均有親緣關系，親緣關系的遠近和地理分布沒有必然的聯(lián)系。

1.4 ISSR分子標記在甜菜其它方面的應用

Kiyoshi[15]等人分別從甜菜葉片、根以及葉柄中提取立枯絲核菌，利用后代的體細胞親和性分組研究了田間分離株的遺傳變異，體細胞相容性群體的數(shù)量與獲得親本分離株的宿主植物組織密切相關，來自根和葉柄的分離物往往是遺傳異質性的，并且產生多個體細胞親和組，而來自葉的分離物傾向于是均質的，并且產生單一的體細胞親和組，這些發(fā)現(xiàn)得到了ISSR分析結果的支持，表明均質分離物產生了具有相同基因型的后代，而異源分離物產生了具有不同基因型的后代。Fayed等人[1]分別利用3個不同耐蟲基因型的甜菜，采用同工酶技術和ISSR分子標記技術，找到了與耐蟲相關聯(lián)的ISSR標記。Sen等人[16]利用ISSR標記分析用γ射線輻射誘導的耐旱甜菜突變體，在對照和耐旱突變體中檢測到多態(tài)性，利用19條ISSR引物，共擴增出106個PCR片段，其中91個為多態(tài)性片段。劉乃新等[17]篩選出了5條ISSR引物，建立了甜菜老化處理后ISSR特異性譜帶。劉乃新等人[18]還對甜菜ISSR引物擴增產物的檢測方法進行了研究，分別對使用6%的聚丙烯酰胺凝膠以及2%的瓊脂糖檢測的使用范圍進行了分析，指出對于指紋圖譜的構建以及遺傳多樣性的分析等適宜于用6%的聚丙烯酰胺凝膠，而品種純度檢測則需要使用2%的瓊脂糖凝膠。

2 ISSR分子標記技術在甜菜育種中應用的前景與展望

隨著分子生物學的發(fā)展，ISSR分子標記技術具有容易操作、可靠性高、重復性強、多態(tài)性好等優(yōu)點，已趨于成熟。ISSR已被成功地應用于估計多種作物品種如水稻[19]、小麥[20]、穇子[21]、豇豆[22]、甘薯[23]和車前草[24]的遺傳多樣性分析；在一項關于白羽扇豆的研究中，已經證明在10個引物中，任何兩個都足以區(qū)分所研究的37份材料[25]；同樣，4個引物足以區(qū)分34個品種的馬鈴薯[26]，3個引物能夠區(qū)分16個紅漿果基因型[27]，使用這種高信息量的引物降低了多樣性分析的成本、時間和勞動力。盡管ISSR標記具有較高的效率和可重復性，但尚未廣泛使用，然而，在解決亞洲栽培稻[19]、小麥[20]、穇子[21]、豇豆[22]和二行芥物種[28]的系統(tǒng)發(fā)育有關的問題方面已被發(fā)現(xiàn)是有效的；另外ISSR分子標記還廣泛應用到遺傳圖譜的構建上，如在日本和歐洲落葉松基因組的圖譜中，ISSR也與AFLP和RAPD標記一起使用[29]。柑橘的遺傳連鎖圖譜使用75個ISSR標記，分布在所有連鎖群中[30]。與重要的農藝性狀密切相關的DNA標記極大地促進了作物改良計劃。在水稻中，將由引物（AG）8YC產生的ISSR標記轉化為序列標簽位點（STS）標記以鑒定育性恢復基因Rf-1[31]。在鷹嘴豆中，由引物（AG）8YT和UBC 8251200引物（AG）8T產生的ISSR標記UBC 855500與賦予對枯萎病的種族4抗性的基因[32]連接。

目前ISSR分子標記技術在甜菜上的應用還比較少，未來應積極地拓寬該技術在甜菜遺傳育種研究上應用的深度，特別是在甜菜遺傳多樣性分析、種質資源鑒定、品種鑒定以及抗性育種等方面，積極借鑒在其他作物上成功應用的經驗，可有效縮短育種年限、提高育種效率，推動甜菜遺傳育種的研究發(fā)展，促進甜菜品種的育成和更新?lián)Q代。