解淀粉芽孢桿菌TWC2誘導(dǎo)甘蔗抗病性相關(guān)防御酶系的研究

梁艷瓊 ，吳偉懷 ，2，黃興 ，習(xí)金根 ，李銳 ，鄭金龍 ，賀春萍 *，易克賢 *

（1．中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵檢測與控制重點開放實驗室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測監(jiān)控重點實驗室，海南?？?71101；2．農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實驗站，海南儋州571737）

甘蔗是我國最主要的糖料作物，種植面積和產(chǎn)糖量均占全國的90%以上[1]。近幾年來，隨著現(xiàn)代甘蔗產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在過度追求高產(chǎn)與經(jīng)濟效益的發(fā)展模式下以及國外品種引進、各蔗區(qū)間相互頻繁調(diào)種，為甘蔗重要病害的擴散提供了條件，再加上甘蔗種植區(qū)生態(tài)的多樣性和復(fù)雜性，甘蔗病害種類和類型逐年增加，而且病害程度也逐年擴大，在種植過程中甘蔗病害因防治不力導(dǎo)致影響范圍逐漸擴大，給我國的甘蔗安全生產(chǎn)帶來了嚴重隱患[2-6]。目前世界上已知的甘蔗病害已達160余種，我國發(fā)現(xiàn)的有60多種，其中大陸蔗區(qū)發(fā)生的約50種[7]。甘蔗病害是造成甘蔗減產(chǎn)的主要因素，抗病品種選育和化學(xué)防治是目前防治甘蔗病害的主要措施，然而抗病品種選育不僅周期長，而且易因病原致病性的分化而喪失抗性，長期施用化學(xué)農(nóng)藥，不僅造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留，而且易使病原菌產(chǎn)生耐藥性[8]，因此亟待尋求一種更持久、更安全的防治措施。

近年來，隨著生防農(nóng)藥的推廣使用，人們逐漸認識到生物防治的巨大發(fā)展前景，因而植物的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性作為一種重要的生防措施也日益受到國內(nèi)外的重視[9-10]。誘導(dǎo)寄主細胞改變物理結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生生理生化反應(yīng)是植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的兩個主要機制，其中生理生化反應(yīng)變化主要是通過影響植物抗病相關(guān)防御酶的催化活動來實現(xiàn)的，主要包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶[11]。目前已有大量研究報道生防微生物能夠誘導(dǎo)這些植物抗病相關(guān)防御酶發(fā)生變化，從而增強植物抗病能力[12]，因此，有關(guān)解淀粉芽孢桿菌誘導(dǎo)植物抗病性已成為了研究熱點。王璐瑤等報道了解淀粉芽胞桿菌B1619灌根處理后番茄葉片POD、SOD和PAL活性比未處理的顯著提高；MDA含量比未處理的顯著降低[13]。谷醫(yī)林等用解淀粉芽胞桿菌LJ1發(fā)酵上清100倍稀釋液噴施黃瓜幼苗，測定黃瓜葉片中SOD、PPO、PAL三種酶的活性在不同時間點均有一個驟增的過程，其活性顯著高于對照[14]。本實驗室前期在臺灣草上分離獲得一株廣譜抗性的解淀粉芽孢桿菌TWC2，以甘蔗葉片中與抗病相關(guān)防御酶類SOD、CAT、PAL、POD和PPO及MDA的含量為指標，通過TWC2菌株發(fā)酵液噴施處理甘蔗植株，測定甘蔗葉片中SOD、CAT、PAL、POD和PPO以及MDA含量的變化情況，明確TWC2菌株誘導(dǎo)甘蔗植株抗病性的能力，為進一步深入研究TWC2菌株的生防作用機理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生防菌解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）TWC2，分離自熱帶牧草臺灣草植株葉片，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所提供。甘蔗品種采用桂蔗24號，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 TWC2發(fā)酵液制備 將解淀粉芽孢桿菌TWC2菌株在 LB培養(yǎng)基（蛋白胨 10g，酵母浸出粉 5g，氯化鈉10g，瓊脂粉15～20g，蒸餾水1000 mL，pH自然）平板中活化，34℃恒溫培養(yǎng) 24 h得到活化的TWC2菌株單菌落，然后挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于34℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 h即得TWC2種子液。按5%的接種量將TWC2種子液接入LB培養(yǎng)基中，34℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)48 h獲得TWC2發(fā)酵液。活菌計數(shù)后用無菌水稀釋至108CFU/mL的菌懸液備用。以108CFU/mL菌懸液為1倍原液，用無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度，稀釋獲得10倍稀釋液及100倍稀釋液。

1.2.2 TWC2發(fā)酵液誘導(dǎo)處理 待甘蔗苗長至30 cm左右時，選取長勢一致的健康植株布置盆栽試驗。設(shè)置4個處理，處理1為1倍原液，處理2為10倍稀釋液，處理3為100倍稀釋液，處理4以噴灑等量LB液體培養(yǎng)基為對照。分別取50 mL上述不同處理的培養(yǎng)液均勻噴灑植株葉面，每處理20株。

1.2.3 甘蔗植株抗病相關(guān)防御酶活性測定 各處理組分別于噴灑后第24、48、72、96和120 h隨機選取5株甘蔗苗，采集每株植株的頂端葉片1g，加入提取液在冰上研磨至勻漿，提取粗酶液，取上清液用于CAT、SOD、POD、PAL和PPO酶活測定。各物質(zhì)測定分別采用CAT試劑盒（CAT-1-Y）、SOD試劑盒（SOD-1-Y）、POD試劑盒（POD-1-Y）、PAL試劑盒（PAL-1-Y）、PPO試劑盒（PPO-1-Y）。試劑盒均由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供，測定方法根據(jù)各試劑盒使用說明進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)用Excel 2007作圖，采用SAS統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片CAT活性變化

由圖1可知，經(jīng)TWC2噴灑處理后，各濃度處理組的CAT活性均高于對照組，其中10倍和1倍稀釋液處理組活性均表現(xiàn)為隨時間的增加先升高直至峰值后逐漸降低，且CAT酶活性分別在48和72 h達到峰值，此時酶活差異最大，與對照處理組差異最顯著（P＜0．01）；而100倍稀釋液處理組CAT酶活略高于對照，但差異不顯著（P＞0．05），且其酶活隨時間的增加呈平穩(wěn)的趨勢。

2.2 TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片PAL活性變化

由圖2可知，PAL活性測定結(jié)果表明，10倍稀釋液處理組PAL活性呈先上升后下降的趨勢，并在第72h時達到峰值，是對照組的2．24倍；1倍稀釋液處理組PAL活性在48 h出現(xiàn)短暫降低后持續(xù)增高，在第96h時達到峰值184．59 U/g，與對照組差異達到顯著；100倍稀釋液處理組與對照組的PAL活性在各時間點均無顯著性差異，也沒有出現(xiàn)明顯峰值，可能是菌液濃度太低。

2.3 TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片POD活性變化

由圖3可知，經(jīng)TWC2發(fā)酵液處理后，10倍稀釋液處理組的POD在0～72h呈急速增長的趨勢，在72h時達到峰值26746．38 U/g，與對照組活性差異達到極顯著水平；1倍稀釋液和100倍稀釋液處理組POD活性先緩慢上升，在96h時達到峰值后緩慢下降，峰值分別為15715．63 U/g和 10414．18U/g，是對照組的 3．61和 2．20倍，與對照組的差異分別達到極顯著和顯著水平。

2.4 TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片SOD活性變化

SOD活性測定結(jié)果（圖4）表明，經(jīng)TWC2發(fā)酵液誘導(dǎo)后的3個處理組SOD活性均呈現(xiàn)先急劇增長后下降的趨勢，活性變化明顯，且在誘導(dǎo)后第48h到達峰值，其中1倍和10倍稀釋液兩個處理組 SOD活性分別達到 1402．86和1244．53 U/g，是對照組的 5．42 和 4．81 倍，與對照組差異達極顯著水平；100倍稀釋液處理組的酶活是對照組的2．33倍，峰值為604．70 U/g，對照組的酶活變化不大，與其他3組處理SOD酶活差異顯著。

2.5 TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片PPO活性變化

PPO活性測定結(jié)果（圖5）表明，經(jīng)TWC2發(fā)酵液噴灑誘導(dǎo)后的處理組PPO活性均表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，對照組的PPO活性基本無明顯變化。經(jīng)TWC2發(fā)酵液誘導(dǎo)處理后，10倍稀釋液處理組PPO活性在第48 h達到最高值63．71 U/g，是對照組的2．46倍，與對照差異極顯著，誘導(dǎo)效果最好；1倍稀釋液處理組的PPO活性峰值在第48h出現(xiàn)，是對照組的1．59倍，與對照組差異顯著，但在隨后的時間內(nèi)無明顯變化；100倍稀釋液處理組的PPO活性在第48 h達到峰值，而后緩慢降低至與對照接近的水平，與對照差異不顯著。

2.6 TWC2發(fā)酵液處理后對甘蔗葉片MDA含量的影響

由圖6可知，對照組的MDA含量比較穩(wěn)定，無明顯變化。與對照處理組相比，10倍稀釋液處理組MDA含量在24～48h時下降，比對照組降低了43．12%，之后MDA含量呈上升-下降趨勢，在72h達到峰值。1倍稀釋液和100倍稀釋液處理組的MDA含量呈先上升后降低的趨勢，并在72h時達到峰值，MDA含量分別為10．13μmoL/g 和 11．64μmoL/g。

3 討論

誘導(dǎo)植物抗病性包括系統(tǒng)獲得抗病性和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。由生物防治拮抗菌所引起的植物系統(tǒng)抗病性屬于誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。寄主防御酶系、病程相關(guān)蛋白（PR-蛋白）、活性氧現(xiàn)象及木質(zhì)素的積累是誘導(dǎo)抗性的重要表征[15]。SOD和POD是植物體內(nèi)清除活性氧毒性的保護酶，POD還能催化酚類物質(zhì)合成木質(zhì)素，使受侵染組織的木質(zhì)化程度加深，SOD、POD活性的高低與植物抗逆性密切相關(guān)[16]。PAL是苯丙烷類代謝途徑的限速酶與關(guān)鍵酶，其參與代謝途徑合成的中間產(chǎn)物（如酚類物質(zhì)、木質(zhì)素等）是植物體內(nèi)重要的抗菌物質(zhì)[15，17]。CAT作為重要的內(nèi)源活性氧清除劑，可以清除體內(nèi)的過氧化氫，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[18]。喬俊卿等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌菌株P(guān)TS-394灌根番茄后，番茄葉片中PAL、POX、LOX和PPO的活性均有不同程度的持續(xù)增加，誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，從而提高其對番茄灰霉病的抗性[19]。陳劉軍等研究發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)芽孢桿菌AR156誘導(dǎo)水稻植株提高了PAL、SOD、CAT和POD等防御酶活性，從而提高水稻對紋枯病的抗性[20]。由此可知，生防菌對植物抗病相關(guān)防御酶的誘導(dǎo)是生防微生物防治植物病害發(fā)生的重要機制之一。本研究通過測定施用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液后甘蔗葉片不同生長時期與誘導(dǎo)植物抗病性密切相關(guān)的植株酶活力（PAL、POD、SOD、PPO、CAT）變化的結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片幾種防御酶活力均有所上升，這個結(jié)果說明TWC2一定程度上誘導(dǎo)了甘蔗體內(nèi)抗性酶活性的增高，使甘蔗植株產(chǎn)生了更高的抗病酶活力，增強了植物的抗病能力，進一步說明了其作為生物農(nóng)藥的良好應(yīng)用前景。

本研究中經(jīng)解淀粉芽孢桿菌TWC2發(fā)酵液10倍稀釋液處理甘蔗葉片，葉片中抗病相關(guān)酶系（PAL、SOD、POD、PPO）顯著高于其他濃度處理，與唐文等[18]、傅瑩等[21]的研究結(jié)果相符，表明提高發(fā)酵液濃度并不一定能誘導(dǎo)植株防御酶活性升高，拮抗菌發(fā)酵液濃度與誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的效果并非呈正相關(guān)。

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化分解的主要產(chǎn)物，其含量的高低反映了植物細胞膜受損害程度以及植物耐受逆境條件的能力，MDA的大量累積可影響電解質(zhì)外滲，嚴重時甚至可使細胞死亡[21]。本試驗結(jié)果表明，施用TWC2發(fā)酵液后，其體內(nèi)的抗病相關(guān)防御酶水平會顯著提高，而MDA含量變化呈平穩(wěn)趨勢，與對照組相比，處理組的MDA含量均顯著降低，證明TWC2菌株可有效抑制因病原菌作用引起的MDA含量升高，降低甘蔗植株受損害的程度，提高植株的抗病性。