西紅花花瓣不同烘干工藝提取物HPLC指紋圖譜研究

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(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

西紅花是鳶尾科(Iridaceae)番紅花屬(Crocus)植物番紅花(Crocus sativus L.)干燥的柱頭[1]，又名藏紅花、咱夫蘭.元朝時由“天方國”傳到西藏再傳入中原，最早見于元朝飲膳太醫(yī)忽思慧所著《飲膳正要》：“咱夫蘭，味甘，平，無毒.主心憂郁積，氣悶不散，久食令人心喜.”其入藥部位花柱的產(chǎn)量極低，價格昂貴，被譽(yù)為“植物黃金”.西紅花花瓣是制藥工業(yè)中的副產(chǎn)物，含有許多的活性成分，已有學(xué)者從中分離得到黃酮、多糖、皂甙等物質(zhì)[2-3]，現(xiàn)代藥理藥效顯示，西紅花花瓣具有抗氧化、抗抑郁和抑制酪氨酸酶等[4-6]多種藥理活性.目前已經(jīng)分離得到了以山奈酚為苷元的黃酮苷類化合物、單萜類以及單苯環(huán)類化合物共35個.指紋圖譜技術(shù)是國際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的最常用手段[7].相似度評價、主成分分析與聚類分析在中藥指紋圖譜研究中最常使用[8]，通過聚類分析可以將對象集合中相近或者相似的對象聚集到同一個類中，最后得到幾個不同的類劃分[9].西紅花花瓣不易儲存，目前尚沒有對西紅花花瓣的烘干的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同的烘干方法對西紅花花瓣中主要化學(xué)成分影響的研究未見報道.本實(shí)驗基于西紅花花瓣的HPLC指紋圖譜技術(shù)，探討烘干工藝對對西紅花花瓣化學(xué)成分的影響，并尋找最優(yōu)烘干工藝.

1 儀器與試藥

Agilent 1260 HPLC液相色譜儀(美國Agilent公司)；KQ-100DE超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司)；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司)；WD700微波爐(樂金電子電器有限公司)；0.45 μm有機(jī)針孔過濾器(上海興亞凈化材料廠)；乙腈、甲醇為色譜純(美國Tedia公司)；哇哈哈純凈水.

新鮮西紅花花瓣(產(chǎn)地浙江省建德市三都鎮(zhèn)和村，批次：2016年)，經(jīng)浙江工業(yè)大學(xué)大學(xué)王平教授鑒定為CrocussativusL.的新鮮花瓣；對照品山奈酚3-O-槐糖苷、異鼠李素3,4’-二-O-β-葡萄糖苷為實(shí)驗室分離制得，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR鑒定結(jié)構(gòu).

2 試驗方法

2.1 西紅花花瓣的烘干方法

取新鮮西紅花花瓣約10 g，精密稱定，置于不同烘干設(shè)備中，按照表1的烘干參數(shù)進(jìn)行干燥，取出，再次精密稱定，然后將樣品放置在干燥器中，備用，一式三份.測定樣品脫水率，制作指紋圖譜.新鮮西紅花花瓣的脫水率公式為

脫水率=[(M1-M2)/M1]×100%

式中：M1，M2分別為脫水前后樣品質(zhì)量.

表1 樣品參數(shù)及脫水率Table 1 Parameter and dehydration rate of samples

注：1) P1～P8為恒溫鼓風(fēng)干燥法；Z1～Z6為真空干燥法；L1為冷凍干燥法；W1～W8為微波干燥法.

2.2 待測液的制備

供試品溶液的制備：取西紅花花瓣約100 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液10 mL，稱重，在40 ℃下超聲提取40 min，采用70%甲醇溶液補(bǔ)足重量，搖勻，過濾，濾液再用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

對照品溶液的制備：分別取山奈酚3-O-槐糖苷和異鼠李素3,4’-二-O-β-葡萄糖苷約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，溶液用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

2.3 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)；流速0.5 mL/min；檢測波長260 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動相為乙腈(A)和0.05%三氟乙酸(B)；梯度洗脫時A和B的比例為0～5 min，5∶95；5～10 min，20∶80；10～25 min，20∶80；25～30 min，50∶50；30～40 min，70∶30.

2.4 方法學(xué)考察

1) 精密度的考察.取同一份供試液，按2.3項下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果各特征色譜峰峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation RSD)分別小于2.36%和1.01%.采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件計算相似度為1，說明儀器的精密度較好.

2) 重復(fù)性的考察.取同一批花瓣樣品5份，分別按照2.2項下的方法制備成供試液，依次進(jìn)樣，結(jié)果各特征色譜峰峰面積和保留時間的RSD值分別小于2.69%和1.34%，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件計算相似度均高于0.99，說明該方法的重復(fù)性較好.

3) 穩(wěn)定性的考察.取同一份供試液，分別于0，4，8，12，16 h分別進(jìn)樣，結(jié)果各特征色譜峰峰面積和保留時間的RSD值分別小于3.68%和0.96%，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件計算相似度均高于0.99，說明供試液在16 h之內(nèi)穩(wěn)定性較好[10].

2.5 指紋圖譜的建立

以鮮花瓣為參照，取新鮮西紅花花瓣500 mg,按2.2項下方法制備供試液，供試液指紋圖譜共標(biāo)識9個共有特征峰(圖1).其中，6和7號峰分別對應(yīng)山奈酚3-O-槐糖苷和異鼠李素3,4’-二-O-β-葡萄糖苷(17.02，19.01 min).

圖1 新鮮西紅花花瓣指紋圖譜Fig.1 The fingerprint of fresh petals of Crocus sativu

3 試驗結(jié)果

3.1 西紅花花瓣脫水率

不同參數(shù)下西紅花花瓣脫水率如表1所示，普通恒溫鼓風(fēng)干燥箱在70，80 ℃下干燥45 min、真空干燥箱在70，80 ℃下干燥45 min、冷凍干燥和微波干燥，脫水率均高于80%，冷凍干燥較為費(fèi)時，不利于工業(yè)生產(chǎn)，而微波干燥效率較高.4種干燥方法的脫水速率為，微波干燥>普通干燥、真空干燥>冷凍干燥.

3.2 干燥工藝對西紅花花瓣指紋圖譜特征峰的影響

西紅花花瓣中含有大量黃酮類成分，在260 nm(帶Ⅱ)處有較強(qiáng)的紫外吸收，且該波長下指紋圖譜中的色譜峰個數(shù)較多，分離度良好，故設(shè)260 nm為檢測波長.由于編號P1，P2，P3，Z1，4批樣品含水量較多，很快發(fā)生霉變，故沒有進(jìn)一步分析，其余的19批不同干燥條件下的花瓣樣品(S2～S20)和新鮮花瓣樣品(S1)的指紋圖譜色譜峰疊加圖如圖2所示.采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版軟件”[11]進(jìn)行相似度分析，以鮮花瓣圖譜為參照譜[12]，結(jié)果各譜圖相似度大于0.97(表2)，說明不同烘干方法和烘干工藝的樣品化學(xué)成分種類差異性較小，物質(zhì)基礎(chǔ)沒有變.共有的9個特征峰峰面積除以樣品干重的RSD值計算結(jié)果顯示，峰2，3，5，8的RSD值均大于50%，其中峰8高達(dá)92.70%(表3)，說明不同樣品雖然化學(xué)成分種類差異較小，但化學(xué)成分含量差異性明顯，因此烘干方法和烘干工藝主要對西紅花花瓣中化學(xué)成分含量造成較大影響.圖2顯示，整體上烘干后的樣品各色譜峰強(qiáng)度均有所減弱，尤其是2，3，6，8號色譜峰.普通干燥P7(S6)、真空干燥Z3(S9)樣品在該濃度下無法檢測到2號峰，且普通干燥條件下所有的3號峰強(qiáng)度大幅度減弱.另外，普通干燥、真空干燥和冷凍干燥條件下所有的8號色譜峰強(qiáng)度也大幅度減弱，但微波干燥對該峰的保留較佳.通過計算，W6色譜峰峰面積/干重的合計值最高，說明中高火微波8 min可以較好的保留西紅花花瓣的化學(xué)成分，該烘干方法為干燥花瓣的較佳方法.

表2 不同樣品HPLC指紋圖譜相似度Table 2 Similarity of fingerprint from different samples

表3 9個共有峰的峰面積/干重的RSDTable 3 RSD of peak area/ dry weight from 9 common peaks

S1—鮮花瓣樣品；S2～S6—P4～P8；S7～S11—Z2～Z6；S12—L1；S13～S20—W1～W8圖2 20批樣品HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of 20 samples

3.3 聚類分析

將上述19批西紅花花瓣烘干樣品的峰面積/干重的值導(dǎo)入SPSS 19.0軟件，如圖3所示，可將樣品大致分為2大類，分別為W7，W2，W4，W5，W3，Z4，W8，P7，W6，Z6和Z5聚為一類，這些樣品中9個特征峰的峰面積/干重的合計值排在前11位；另外一些樣品聚為一類.說明通過工藝優(yōu)化，微波干燥法、真空干燥法和普通干燥法均能有效保留樣品中有效成分的含量，樣品之間的指紋圖譜相似度良好.除了W1，微波干燥均屬于第一類，說明微波干燥對西紅花花瓣化學(xué)成分影響較穩(wěn)定，且微波干燥法的烘干時間遠(yuǎn)少于其他方法，有利于節(jié)約能源，說明微波干燥法是一種良好的西紅花花瓣干燥方法.

圖3 19批西紅花花瓣樣品平均連接樹狀圖Fig.3 Dendrogram clustering of 19 petals of Crocus sativu

4 結(jié) 論

研究了普通鼓風(fēng)干燥、真空干燥、微波干燥和冷凍干燥法對西紅花花瓣的脫水效率和化學(xué)成分含量的影響，通過比較這些樣品的HPLC指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)烘干方法和烘干參數(shù)主要是對化學(xué)成分的含量影響較大，而對化學(xué)成分的種類影響較小.結(jié)合脫水效率值，發(fā)現(xiàn)微波干燥法是一種良好的西紅花花瓣干燥方法，當(dāng)用中高火微波烘干8 min時，樣品中有效成分含量最高，該方法可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn).此外，筆者建立的西紅花花瓣HPLC指紋圖譜也為該品種質(zhì)量評價與控制提供了科學(xué)依據(jù).

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