液相色譜—穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用鑒定咖啡飲料中咖啡因天然來(lái)源

丁博 王志元 陳文銳 謝建軍 佘志剛

摘 要 建立了液相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用 （LC-IRMS）檢測(cè)咖啡因的δ13C分析方法，用于鑒定咖啡飲料中咖啡因天然來(lái)源的真實(shí)性。樣品中咖啡因經(jīng)液相色譜分離純化，色譜條件為： XBridge Shild RP C18色譜柱（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）， 柱溫50℃，流動(dòng)相為超純水，流速400 μL/min； 再通過(guò)LC-IsoLink實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物全部氧化為CO2氣體，最終以氣態(tài)形式進(jìn)入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀，直接檢測(cè)樣品中咖啡因的δ13C。檢測(cè)44個(gè)不同產(chǎn)地來(lái)源的咖啡豆樣品中咖啡因的δ13C，其范圍是25.3‰～30.9‰， δ13C平均值δaverage=27.9‰， 標(biāo)準(zhǔn)偏差s=1.3‰，以3倍δ13C標(biāo)準(zhǔn)偏差s為判斷依據(jù)，檢測(cè)16個(gè)咖啡飲料樣品的咖啡因δ13C，結(jié)果表明，1個(gè)咖啡飲料樣品中咖啡因δ13C在3倍標(biāo)準(zhǔn)差線附近（δaverage-3s， 31.7‰）， 判別其咖啡因?yàn)榉强Х榷箒?lái)源。LC-IRMS同位素質(zhì)譜測(cè)定咖啡因δ13C的分析方法，可用于鑒別咖啡飲料天然來(lái)源的真實(shí)性。

關(guān)鍵詞 液相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用； 咖啡飲料； 咖啡因

1 引 言

咖啡和咖啡飲料是常見(jiàn)的飲品[1]，具有提神的作用，其主要功效成分是咖啡因[1]。適量攝入咖啡因能振作精神、增強(qiáng)思考能力、提高心臟功能、緩解肌肉疲勞[2，3]。飲用天然咖啡因比人工合成咖啡因更加健康，因?yàn)槿斯ず铣煽Х纫蚩赡軙?huì)導(dǎo)致焦慮癥、睡眠失調(diào)等副作用[4，5]。伴隨著天然咖啡因需求量增大，其導(dǎo)致價(jià)格越來(lái)越高，一些不法廠商以人工合成咖啡因替代天然咖啡因。如何鑒別天然咖啡因與人工合成咖啡因，是咖啡飲料天然成分鑒定的關(guān)鍵技術(shù)難題。

穩(wěn)定同位素技術(shù)是食品摻雜和溯源分析領(lǐng)域一項(xiàng)重要技術(shù)，尤其是特定化合物同位素分析技術(shù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用的完善，使同位素質(zhì)譜技術(shù)在食品領(lǐng)域得到迅速的發(fā)展[6，7]。氣相色譜-同位素質(zhì)譜（GC-IRMS）與液相色譜-同位素質(zhì)譜（LC-IRMS）是兩種主要的特定化合物同位素分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域[8]。GC-IRMS由于具有良好的接口串聯(lián)技術(shù)，在食品摻雜與溯源分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，GC-IRMS主要適用于揮發(fā)性或半揮發(fā)性目標(biāo)物同位素質(zhì)譜分析[9，10]。與GC-IRMS同位素質(zhì)譜技術(shù)相比， LC-IRMS同位素質(zhì)譜技術(shù)可應(yīng)用于非揮發(fā)性有機(jī)物的測(cè)定，尤其是不需要衍生化直接進(jìn)行同位素質(zhì)譜分析[11]。自2004年賽默飛公司推出第一款市場(chǎng)化的LC與IRMS串聯(lián)接口LCisoLink[12]以來(lái)，LC-IRMS同位素質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于考古學(xué)、地球化學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品鑒定等領(lǐng)域。McCullagh等[13]采用LC-IRMS檢測(cè)人和動(dòng)物骨頭中氨基酸的δ13C，利用復(fù)合型色譜柱，硫酸溶液為流動(dòng)相，室溫條件下分離15種氨基酸，IRMS測(cè)定氨基酸的δ13C，最終重現(xiàn)古代人和動(dòng)物的飲食結(jié)構(gòu)； Powers等[14]運(yùn)用LC-IRMS檢測(cè)天然水中碳同位素比，以此定量分析水體中溶解無(wú)機(jī)碳含量，以及水體中溶解有機(jī)碳光化學(xué)作用的轉(zhuǎn)化率。Basler等[15]利用LC-IRMS檢測(cè)土壤中單糖的δ13C，通過(guò)單糖碳同位素比探討土壤不同碳水化合物動(dòng)態(tài)變化； Cabaero等[16]運(yùn)用LC-IRMS檢測(cè)蜂蜜中蔗糖、果糖和葡糖糖的δ13C，結(jié)合EA-IRMS檢測(cè)蜂蜜中蛋白質(zhì)的δ13C，鑒別C3植物蜂蜜是否摻雜C4植物糖。盡管LC-IRMS同位素質(zhì)譜技術(shù)已在地球科學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域得到應(yīng)用，但是LC-IRMS同位素質(zhì)譜技術(shù)在應(yīng)用中仍然存在很大問(wèn)題，如色譜流動(dòng)相必須為純水體系、 不能用有機(jī)流動(dòng)相、 液相色譜柱選擇受限，嚴(yán)重影響LC-IRMS同位素質(zhì)譜技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。

為了克服LC-IRMS同位素質(zhì)譜技術(shù)必須采用水相流動(dòng)相而導(dǎo)致色譜分離洗脫能力低的問(wèn)題，研究者通過(guò)提高色譜柱柱溫的方式增大水溶液的洗脫效率。Godin等[17]首先將此方法用于LC-IRMS中，利用磺化聚苯乙烯-苯二乙烯聚合柱和多孔石墨化柱兩根色譜柱高溫分離對(duì)香豆酸和阿魏酸等酚酸化合物，聚合柱溫度保持在90℃，多孔石墨化柱最高溫度升至170℃，IRMS測(cè)定酚酸特定化合物的δ13C。 Zhang等[18]在150～200℃高溫條件下，采用Xbridge、Acquity、Triart和Zirchrom PBD等不同廠家反相C18色譜柱，以純水為流動(dòng)相，分離苯酚和咖啡因等化合物，用IRMS檢測(cè)這些特定化合物的δ13C。Kujawinski等[19]利用LC-IRMS檢測(cè)磺胺類藥物的δ13C，選擇Xbridge C18色譜柱，柱溫60～100℃，磷酸鹽緩沖溶液為流動(dòng)相，洗脫磺胺類藥物。研究表明，反相C18色譜柱在高溫純水流動(dòng)相條件下，色譜峰擴(kuò)展甚至趨于扁平，C18色譜柱不能長(zhǎng)時(shí)間在高溫條件下使用[20，21]。

20世紀(jì)60年代，科研人員通過(guò)放射性碳同位素分析鑒別飲料中咖啡因天然或人工合成來(lái)源[22]。2003年， Richling等[24]利用EA-IRMS離線檢測(cè)瓜拉納飲料、茶葉、咖啡飲料咖啡因的δ13C，樣品首先通過(guò)分析型液相色譜儀分離提取獲得的咖啡因單體化合物，純咖啡因化合物引入EA-IRMS同位素質(zhì)譜儀，測(cè)定獲得咖啡因的δ13C，從而鑒別飲料中咖啡因是否為天然來(lái)源。2012年，Zhang等[18，24]利用LC-IRMS同位素質(zhì)譜儀在線檢測(cè)飲料中咖啡因的δ13C，選擇Xbridge C18色譜柱，柱溫30～180℃，檢測(cè)咖啡因的δ13C。本研究基于高溫液相色譜聯(lián)用LC-IRMS同位素質(zhì)譜技術(shù)[17，18]，探討LC-IRMS同位素質(zhì)譜在線檢測(cè)咖啡豆、咖啡飲料中咖啡因的δ13C。結(jié)果表明，Xbridge C18色譜柱柱溫超過(guò)70℃后，色譜峰變寬而偏平，色譜柱壽命銳減，因此，選擇在純水流動(dòng)相和恒溫條件下，以Xbridge shild RP C18色譜柱分離咖啡因，優(yōu)化色譜柱的長(zhǎng)度與粒徑，獲得最佳LC-IRMS在線分析條件，用于天然咖啡豆和咖啡飲料中咖啡因的δ13C值的測(cè)定，分析咖啡因δ13C數(shù)據(jù)，判斷咖啡飲料中咖啡因天然來(lái)源的真實(shí)性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Dionex UltiMate3000 型高效液相色譜儀、DELTA V Advantage 同位素質(zhì)譜儀和 FINNIGAN LC IsoLink接口（美國(guó) Thermo Scientific 公司）； Milli-Q 超純水儀（美國(guó) Millipore 公司）；SW 30H 型超聲波儀（瑞士 SONO公司）；SIGMA 3-30KS 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó) Sigma公司）；Sartorius BT 223S天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

咖啡因同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為IAEA-600（δ13C=27.77‰ ± 0.04‰， 購(gòu)于國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)）； Na2S2O8、 H3PO4等均為分析純（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm） 。

合成咖啡因樣品（1000 mg/L于甲醇，上海安譜公司）；咖啡豆樣品和飲料購(gòu)于廣州市大型超市。

2.2 樣品前處理

咖啡豆用瑙碾缽研磨粉碎，準(zhǔn)確稱量0.500 g 樣品于50 mL離心管中，加入25 mL超純水，振蕩1 min使其混合均勻，超聲提取30 min，10000 r/min離心5 min，取約1 mL上清液，過(guò)0.45 μm濾膜至1.5 mL樣品瓶，用超純水稀釋5倍，進(jìn)行LC-IRMS測(cè)試。

取5 mL咖啡飲料樣品，用超純水稀釋至50 mL，10000 r/min離心5 min，取約1 mL上清液，過(guò)0.45 μm濾膜至1.5 mL樣品瓶，待LC-IRMS測(cè)試。

2.3 LC-IRMS檢測(cè)方法

液相色譜條件：使用Waters XBridge Shild RP C18色譜柱（50 mm × 2.1 mm×3.5 μm）；流動(dòng)相為超純水，流速400 μL/min；柱溫為50℃；進(jìn)樣量10 μL。

LC-IsoLink氣液分離條件：樣品從LC色譜洗脫分離出來(lái)，在氧化反應(yīng)管中與4%Na2S2O8溶液和4%H3PO4溶液混合， 在98.5℃條件下，目標(biāo)化合物全部氧化為CO2，經(jīng)過(guò)氣液在線膜分離單元分離后導(dǎo)入IRMS中。

同位素質(zhì)譜條件：離子源電壓為3.05 kV，電流為0.72 mA；載氣為高純氦氣，壓力為150 kPa；參考?xì)釩O2壓力為190 kPa；真空度1.5 × 104 Pa ，法拉第杯檢測(cè)器接收質(zhì)量數(shù)為44、45和46目標(biāo)離子。

2.4 δ13C值的計(jì)算方法

樣品測(cè)定時(shí)，每個(gè)樣品的分析起始階段和結(jié)尾階段通入高純CO2參考?xì)怏w作為內(nèi)標(biāo)，然后用已知δ13C值的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定高純CO2參考?xì)怏w的δ13C，再以CO2參考?xì)怏w的δ13C值為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)樣品中咖啡因的δ13C值進(jìn)行計(jì)算。采用Isodat3.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液的δ13C的計(jì)算基于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)VPDB，計(jì)算公式為[25]：

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 8.5 軟件（美國(guó) OriginLab公司）分析咖啡樣品檢測(cè)所得的δ13C數(shù)據(jù)，咖啡、咖啡豆、生咖啡豆、咖啡粉和咖啡飲料等不同類別樣品的咖啡因δ13C利用SIMCA 14.0軟件（瑞士 Umetrics公司）進(jìn)行主成分分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 分離條件優(yōu)化

3.1.1 色譜柱的選擇 LC-IRMS同位素質(zhì)譜分析中，液相色譜柱的選擇是關(guān)鍵因素，文獻(xiàn)[26]研究了XBridge BEH C18、Acquity UPLC BEH、Triart C18和Zirchrom共4種型號(hào)液相色譜柱， 在高溫純水流動(dòng)相條件下，其中Waters公司的XBridge C18的色譜柱對(duì)樣品中δ13C值的測(cè)定影響最小。本研究選擇XBridge BEH C18和Xbridge shild RP C18兩種類型的色譜柱分離咖啡豆及咖啡飲料中咖啡因，比較不同長(zhǎng)度以及填料粒徑（XBridge BEH C18 （50 mm × 2.1 mm， 2.5 μm）、XBridge BEH C18 （50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）、 XBridge BEH C18 （100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm） 和XBridge shild RP C18 （50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm） ）4種規(guī)格的色譜柱。結(jié)果表明，4種規(guī)格色譜柱均能實(shí)現(xiàn)咖啡因的分離。柱溫恒定條件下，選擇XBridge BEH C18色譜柱 （50 mm × 2.1 mm， 2.5 μm）分離咖啡因時(shí)，系統(tǒng)壓力過(guò)大，連續(xù)檢測(cè)樣品時(shí)，常發(fā)生壓力過(guò)大導(dǎo)致液相泵停止工作的情況；XBridge BEH C18（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）和XBridge BEH C18 （100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）分離咖啡因時(shí)，咖啡因保留時(shí)間較長(zhǎng)，尤其是后者，色譜分離時(shí)間甚長(zhǎng)，批量檢測(cè)樣品耗時(shí)，影響樣品檢測(cè)效率。Xbridge shild RB C18類型色譜柱適合純水流動(dòng)相體系，色譜分離水溶性化合物分離度高，保留時(shí)間短。因此，選擇XBridge shild RP C18 色譜柱（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）在恒溫純水流動(dòng)條件下分離咖啡因 （圖1）。

3.1.2 流速與柱溫的選擇 LC-IRMS同位素質(zhì)譜測(cè)定目標(biāo)化合物的穩(wěn)定碳同位素比，要求色譜流動(dòng)相不含甲醇或乙腈有機(jī)洗脫液，因此實(shí)驗(yàn)選擇超純水為流動(dòng)相。LC Isolink氣液分離單元允許最大流速500 μL/min，其中氧化劑和酸化劑總流速最大值為100 μL/min，因此，選擇咖啡因色譜分離流動(dòng)相流速為400 μL/min。

高溫條件下，純水可以達(dá)到甲醇和乙腈有機(jī)溶劑的洗脫能力[27]，因此通過(guò)提高純水流動(dòng)相的色譜柱柱溫，實(shí)現(xiàn)咖啡因目標(biāo)物的分離。XBridge shild RP C18耐受最高溫度為60℃，柱溫選擇50℃，以純水流動(dòng)相分離咖啡因目標(biāo)物，長(zhǎng)時(shí)間使用后，咖啡因同位素質(zhì)譜目標(biāo)峰未變寬。因此，LC-IRMS檢測(cè)咖啡因的δ13C分析條件為： XBridge shild RP C18色譜柱（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）、柱溫50℃，純水為流動(dòng)相。

3.2 天然咖啡因同位素質(zhì)譜分析

從市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買44種咖啡豆與咖啡樣品，分別是18種咖啡飲品、11種咖啡豆、7種生咖啡豆和8種咖啡粉，用LC-IRMS同位素質(zhì)譜分析，咖啡因的δ13C值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1?？Х榷辜翱Х忍烊粊?lái)源的咖啡因δ13C值范圍在25.3‰～30.9‰之間，利用t分布統(tǒng)計(jì)學(xué)分析44種樣品的咖啡因δ13C平均值27.9‰， 標(biāo)準(zhǔn)偏差s=1.3‰。同時(shí)檢測(cè)人工合成咖啡因的δ13C值在35.8‰～38.5‰之間。Weinkauff等[22]采用EA-IRMS 檢測(cè)天然來(lái)源茶葉咖啡因，δ13C值在27.7‰～31.7‰之間，天然來(lái)源咖啡中咖啡因的δ13C值在26.5‰～27.5‰之間，天然來(lái)源瓜拉納種子中咖啡因的δ13C值在26.7‰～28.7‰之間，人工合成咖啡因的δ13C值在37.9 ‰～40.0‰之間。因此，本方法檢測(cè)天然來(lái)源及人工合成咖啡因咖啡因的δ13C數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道數(shù)據(jù)一致。

由圖2可知，咖啡、咖啡豆、咖啡粉和生咖啡豆中咖啡因的δ13C值在2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍之內(nèi)，生咖啡豆或烘烤不同類別樣品中咖啡因保持一定穩(wěn)定性。因此，可以根據(jù)天然來(lái)源咖啡產(chǎn)品的咖啡因δ13C值分布規(guī)律鑒別咖啡飲料中咖啡因是否來(lái)源于天然咖啡豆。

3.3 咖啡飲料中咖啡因的測(cè)定

采用建立的LC-IRMS同位素質(zhì)譜測(cè)定咖啡因的δ13C分析方法，測(cè)定市售的16種咖啡飲料中咖啡因的δ13C（表2）。由表2可知，16種咖啡飲料中咖啡因δ13C值與咖啡豆、咖啡等天然來(lái)源咖啡因δ13C值比較相一致，咖啡因δ13C值在1倍標(biāo)準(zhǔn)偏差下限值范圍之內(nèi)，其中只有1種香濃咖啡飲料的咖啡因δ13C值為31.7‰， δ13C值在咖啡豆、咖啡等天然來(lái)源咖啡因的1倍標(biāo)準(zhǔn)偏差和3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差之間，接近3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差下限臨界值（31.8‰），人工成咖啡因δ13C值在35.8‰以下，推斷此香濃咖啡飲料中咖啡因是非咖啡豆天然來(lái)源的咖啡因。

將44個(gè)樣品分為咖啡豆、咖啡粉、生咖啡豆和咖啡4種天然來(lái)源產(chǎn)品，以及1種咖啡飲料產(chǎn)品，LC-IRMS測(cè)試所得咖啡因δ13C值按照5種類別產(chǎn)品類別進(jìn)行主成分分析（圖3）。由主成分分析結(jié)果可知，不同類別咖啡產(chǎn)品的咖啡因δ13C值相對(duì)聚集，其中咖啡豆、生咖啡豆和咖啡3種產(chǎn)品相對(duì)聚集在一起，咖啡粉與咖啡飲料2種類別產(chǎn)品聚集在一起，由此推測(cè)，咖啡飲料為糊狀懸浮液與咖啡粉產(chǎn)品加工工藝程序比較接近，碳穩(wěn)定同位素分餾效應(yīng)相似，導(dǎo)致它們咖啡因的δ13C值相對(duì)分布集中。

4 結(jié) 論

建立了LC-IRMS同位素質(zhì)譜直接測(cè)定咖啡因δ13C值的分析方法，用于咖啡、咖啡豆天然來(lái)源咖啡因和咖啡飲料中咖啡因的測(cè)定。以天然來(lái)源咖啡因的δ13C值分布范圍為依據(jù)，用于鑒別咖啡飲料中咖啡因是否為天然來(lái)源。LC-IRMS同位素質(zhì)譜技術(shù)在食品溯源及品質(zhì)鑒定中具有良好的應(yīng)用前景。

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