豬瘟疫苗中牛病毒性腹瀉病毒污染現(xiàn)狀及鑒別檢測(cè)方法研究進(jìn)展

李 嬌，謝金文，王文秀，李 峰，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）和牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）分別是豬瘟（classical swine fever,CSF）和牛病毒性腹瀉（Bovine viral diarrhea,BVD）的致病原[1]，其中豬瘟是目前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的頭號(hào)殺手，我國(guó)主要采取以疫苗免疫為主的綜合防控措施[2]，BVDV除感染牛外還可感染豬、羊、以及野生動(dòng)物，豬感染BVDV可出現(xiàn)類(lèi)似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化[3]。CSFV與BVDV同屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），兩者的核苷酸序列同源性在60%以上，氨基酸序列同源性在85%以上，存在抗原交叉性和血清學(xué)交叉反應(yīng)[1，4]。豬瘟疫苗在生產(chǎn)過(guò)程中要用牛血清、胰酶、牛睪丸等原輔料，原輔料中若帶有BVDV抗體將抑制豬瘟病毒的體外培養(yǎng)，降低豬瘟疫苗中病毒含量和疫苗效力，導(dǎo)致豬瘟疫苗質(zhì)量不合格。原輔料中若帶有BVDV抗原將會(huì)造成豬瘟疫苗中BVDV外源病毒污染，污染了BVDV的豬瘟疫苗免疫豬群后將對(duì)豬瘟疫苗的免疫效果產(chǎn)生干擾作用，BVDV在抑制豬瘟抗體產(chǎn)生的同時(shí)，可以刺激豬只產(chǎn)生大量針對(duì)BVDV的抗體，而在豬瘟抗體監(jiān)測(cè)時(shí)檢出的高水平抗體效價(jià)中豬瘟保護(hù)性抗體較少，大部分可能為BVDV抗體，導(dǎo)致豬瘟疫苗的免疫失敗，且BVDV污染的豬瘟疫苗免疫后可使豬群感染BVD，給豬瘟的防控帶來(lái)極大的安全隱患和不確定因素[5]。筆者就目前我國(guó)豬瘟疫苗中BVDV的污染現(xiàn)狀及BVDV污染的鑒別診斷方法進(jìn)行綜述，為提高我國(guó)豬瘟疫苗質(zhì)量、保障豬瘟疫苗免疫效果、提升豬瘟綜合防控水平提供參考與借鑒。

1 流行現(xiàn)狀

鞠厚斌等[6]為調(diào)查我國(guó)豬瘟疫苗中BVDV的污染情況，采用RT-PCR方法對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)銷(xiāo)售的6家豬瘟疫苗生產(chǎn)廠(chǎng)家的15份豬瘟活疫苗進(jìn)行了BVDV的核酸檢測(cè)，BVDV核酸陽(yáng)性污染率為26.7%。曹玉美等[7]采用RT-PCR方法對(duì)7個(gè)豬瘟疫苗生產(chǎn)廠(chǎng)家的兔源豬瘟疫苗和細(xì)胞源豬瘟活疫苗共計(jì)10批次樣品進(jìn)行了BVDV污染的檢測(cè)，在兔源豬瘟疫苗中未檢測(cè)到BVDV，但在8批次細(xì)胞源豬瘟疫苗中檢出7批次BVDV污染，陽(yáng)性污染率高達(dá)87.5%。陶潔等[8]采用RT-PCR方法對(duì)國(guó)內(nèi)相關(guān)疫苗廠(chǎng)家2013年生產(chǎn)的10份不同批次豬瘟疫苗進(jìn)行了BVDV污染的篩查，共檢測(cè)出陽(yáng)性樣品1份，陽(yáng)性污染率達(dá)10%。葉兆美[9]為了解四川地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)所用豬瘟疫苗中BVDV的污染情況，采用RT-PCR方法對(duì)10份豬瘟活疫苗進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，BVDV污染率為10%。范仲鑫等[10]為了調(diào)查湖南省豬瘟細(xì)胞苗中BVDV的污染情況，應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)湖南省內(nèi)銷(xiāo)售的10個(gè)生產(chǎn)廠(chǎng)家48個(gè)批次的豬瘟疫苗進(jìn)行了BVDV的核酸檢測(cè)，10個(gè)生產(chǎn)廠(chǎng)家的豬瘟疫苗中有5個(gè)生產(chǎn)廠(chǎng)家檢出BVDV核酸陽(yáng)性，48個(gè)批次中有9批次檢出BVDV核酸陽(yáng)性，陽(yáng)性污染率達(dá)18.75%，表明當(dāng)前湖南省豬瘟疫苗中BVDV污染較嚴(yán)重。張志等[11]采用巢式RT-PCR方法對(duì)7份豬瘟疫苗進(jìn)行BVDV污染的檢測(cè)，并分析BVDV核酸序列的遺傳特性，共檢測(cè)出3份BVDV陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性污染率達(dá)42.86%，分子遺傳分析表明污染的BVDV均屬于BVDV-1型。祖立闖等[12]應(yīng)用套式RT-PCR方法對(duì)生產(chǎn)豬瘟疫苗的原輔料、半成品以及成品疫苗等51份樣品進(jìn)行BVDV污染的檢測(cè)，共檢出陽(yáng)性樣品22份，陽(yáng)性率達(dá)43.14%，所有陽(yáng)性樣品經(jīng)測(cè)序鑒定均為BVDV-1型。范學(xué)政等[13]應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)23個(gè)批次的豬瘟疫苗進(jìn)行BVDV污染的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有5批次疫苗污染BVDV，陽(yáng)性污染率為21.74%，經(jīng)測(cè)序鑒定均為BVDV-1型。以上病原學(xué)調(diào)查資料共同表明，BVDV在國(guó)內(nèi)豬瘟疫苗中已具有一定的污染，且在個(gè)別地區(qū)陽(yáng)性污染率較高，污染情況比較嚴(yán)峻，這將給豬瘟疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量和豬瘟疫病的綜合防控帶來(lái)極大的安全隱患和不確定因素，應(yīng)加強(qiáng)重視。

2 鑒別檢測(cè)方法

目前《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2015年版）中豬瘟疫苗BVDV污染的檢測(cè)方法為細(xì)胞培養(yǎng)法[14]，但該方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、操作較復(fù)雜、不適合快速檢測(cè)，亟待建立可以準(zhǔn)確區(qū)分BVDV和CSFV的敏感、特異的鑒別診斷方法。由于BVDV和CSFV存在高度的抗原交叉性和血清學(xué)交叉反應(yīng)，對(duì)于豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別診斷，主要依靠基于BVDV和CSFV核酸序列差異的分子生物學(xué)方法和基于高特異性單克隆抗體的血清學(xué)方法。

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)法

細(xì)胞培養(yǎng)法為我國(guó)獸藥典中推薦使用的方法，該方法通過(guò)接種易感細(xì)胞、觀(guān)察病變特征等進(jìn)行判定。陶潔等[15]對(duì)上海某豬場(chǎng)送檢的一份疑似BVDV污染的豬瘟疫苗進(jìn)行了BVDV的分離與鑒定，將豬瘟疫苗樣品接種于MDBK細(xì)胞，盲傳15代后仍無(wú)致細(xì)胞病變效應(yīng)，但間接免疫熒光試驗(yàn)表明接種該疫苗后的MDBK細(xì)胞能夠被BVDV-2型的單克隆抗體BZ-53識(shí)別，采用BVDV-1和BVDV-2的5'-UTR的通用檢測(cè)引物和針對(duì)BVDV E2的引物對(duì)病毒RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，樣品能夠擴(kuò)增出約288 bp的BVDV特異性片段，測(cè)序分析結(jié)果表明分離株屬于BVDV-2型，并且其E2基因與牛源XJ-04株（BVDV-2型）的E2基因同源性最高（92.3%），而與豬源ZM-95株（BVDV-1型）E2基因同源性較低（64.5%），表明該豬瘟疫苗中的確污染有1株BVDV-2株。細(xì)胞培養(yǎng)法為動(dòng)物病毒鑒定的經(jīng)典方法，但該方法存在試驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、檢測(cè)成本高，且受細(xì)胞影響較大、有些非致病變的BVDV毒株無(wú)法檢測(cè)、不適合大批量樣品檢測(cè)等缺點(diǎn)，使之無(wú)法成為BVDV污染最有效、便捷的鑒別檢測(cè)方法。

2.2 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到病原體特定的核苷酸序列，可用于豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別診斷。李晶梅等[16]參考GenBank中BVDV和CSFV標(biāo)準(zhǔn)株的基因組序列，選取各自的保守基因區(qū)域設(shè)計(jì)可以進(jìn)行鑒別檢測(cè)的特異性引物，經(jīng)過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了可以對(duì)兩種病毒同時(shí)檢測(cè)的雙重RT-PCR方法，該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感性高，可以用于豬瘟疫苗的質(zhì)量控制，為兩種病毒的交叉污染的檢測(cè)提供一種方便、快捷的方法。祖立闖等[12]根據(jù)GenBank公布的BVDV全基因組序列，選擇BVDV保守性比較高的5'非編碼區(qū)，利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，建立了檢測(cè)BVDV的套式RT-PCR方法，該方法檢測(cè)CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、MDBK正常細(xì)胞、牛傳染性鼻氣管炎病毒、豬偽狂犬病病毒均為陰性，該方法第1輪引物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1 ng RNA，第2輪引物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.1 ng RNA。套式RT-PCR方法極大地提高了常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法的特異性和敏感性，重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高，可以準(zhǔn)確快速檢測(cè)出極低含量的BVDV，為動(dòng)物與疫苗生物制品原輔料中BVDV的快速低含量檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、特異、敏感、快速的檢測(cè)方法。葛玉鳳等[4]為建立一種快速檢測(cè)豬瘟疫苗中BVDV污染的方法，根據(jù)GenBank上登錄的BVDV 5'端非編碼區(qū)基因組序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，經(jīng)一步法RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)豬瘟疫苗中BVDV污染的一步法RT-PCR方法。該方法對(duì)CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒、牛副流感病毒3型、牛傳染性鼻氣管炎病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，對(duì)BVDV基因組RNA的檢測(cè)靈敏度達(dá)0.1 ng，與細(xì)胞培養(yǎng)法的符合率達(dá)100%，應(yīng)用該方法對(duì)豬瘟疫苗、牛血清等138份樣品進(jìn)行BVDV污染的檢測(cè)，陽(yáng)性污染率達(dá)11.59%。一步法RT-PCR檢測(cè)方法采用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，使反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增一步完成，雖然使用商品化的試劑盒提高了檢測(cè)成本，但也節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，減少了操作步驟，降低了污染概率，同時(shí)具有良好的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性和適用性，可用于豬瘟疫苗生產(chǎn)中血清、細(xì)胞、毒種、半成品等的質(zhì)量控制以及豬瘟疫苗臨床應(yīng)用中的質(zhì)量檢驗(yàn)。

2.3 血清學(xué)方法

BVDV和CSFV之間存在高度的血清學(xué)交叉反應(yīng)性，因而難以用普通的血清學(xué)方法將BVDV和CSFV區(qū)分開(kāi)。單克隆抗體具有高度的特異性和敏感性，能夠識(shí)別病毒抗原結(jié)構(gòu)的微小差異，因此，利用BVDV特異性單克隆抗體可以建立區(qū)分BVDV和CSFV的血清學(xué)診斷方法，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別檢測(cè)。范晴等[17]用兔抗BVDV多抗作為包被抗體，BVDV NS3單克隆抗體作為捕獲抗體，建立了檢測(cè)BVDV抗原的捕獲ELISA方法，該方法檢測(cè)CSFV、牛輪狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛分支桿菌均為陰性，其最低可檢測(cè)7.9×103個(gè)TCID50的病毒量，與RT-PCR方法的符合率為100%，所建立的BVDV抗原捕獲ELISA方法快速、特異、敏感，可用于BVDV抗原的鑒別檢測(cè)。

3 小結(jié)與展望

我國(guó)現(xiàn)階段豬瘟流行形勢(shì)復(fù)雜，豬瘟防控任務(wù)仍十分艱巨，豬瘟疫苗質(zhì)量將是影響豬瘟綜合防控的關(guān)鍵，而現(xiàn)階段的病原學(xué)調(diào)查表明我國(guó)豬瘟疫苗中存在一定的BVDV污染，必須加強(qiáng)豬瘟疫苗中BVDV污染的嚴(yán)格監(jiān)測(cè)，一方面要加強(qiáng)牛血清等原輔材料的生產(chǎn)與安全管理，從源頭上遏制BVDV污染的可能性；另一方面要加強(qiáng)疫苗制備中各個(gè)環(huán)節(jié)的監(jiān)督管理，提高疫苗制備工藝的安全性和嚴(yán)謹(jǐn)性，逐步提高豬瘟疫苗質(zhì)量，禁止生產(chǎn)和接種BVDV污染的豬瘟疫苗。在豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別檢測(cè)方法方面，分子生物學(xué)方法彌補(bǔ)了細(xì)胞培養(yǎng)法試驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜以及部分BVDV毒株在細(xì)胞上難以產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變等問(wèn)題，且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，一般實(shí)驗(yàn)室均可選擇使用?；趩慰寺】贵w的血清學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、高通量，非常適合進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，BVDV和CSFV鑒別檢測(cè)方法的逐步完善，豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別檢測(cè)方法將逐步提高，豬瘟疫苗中BVDV的污染率將逐步降低，我國(guó)豬瘟疫苗質(zhì)量將不斷提高，從而保障我國(guó)豬瘟防控事業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。