甘油二酯酰激酶ε相關的非典型溶血尿毒綜合征發(fā)病機制研究進展

汪洪菊 韓飛

溶血尿毒綜合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）屬于血栓性微血管?。╰hrombotic microangiopathy，TMA），其特點是血管內皮細胞受損、微血管內血栓形成，隨之引起靶器官功能障礙、血小板過度消耗致血小板減少性紫癜及非免疫性微血管病性溶血性貧血[1-3]。腎臟是HUS的主要靶器官，神經系統(tǒng)、肺、心臟、胰腺等均可受累[2]。根據病因，HUS 可分為：（1）STEC-HUS：約占 HUS患者的90%，主要發(fā)生在學齡前兒童，由產類志賀毒素的大腸埃希菌（STEC）感染引起，血清型O157：H7最常見。潛伏期4～7d，急性起病，表現為嘔吐、腹瀉、腹痛，血性腹瀉是其顯著特點，2～10d后表現為HUS的典型三聯征（微血管病性溶血性貧血、血小板減少，急性腎衰竭），預后較好；（2）肺炎鏈球菌相關性HUS：因感染產N-神經氨酸苷酶的肺炎鏈球菌而發(fā)病，2歲以下的兒童是易感人群，在兒童HUS中約占5%?？梢鹬旅缘姆窝住⒛X膜炎、敗血癥，預后不佳，急性期病死率25%[4]；（3）非典型 HUS（aHUS）：約占 HUS 患者的 10%[5]，可發(fā)生在任何年齡，復發(fā)率高，預后差，約50%患者發(fā)展為終末期腎?。‥SRD），25%患者死亡[6-7]。aHUS受遺傳因素和環(huán)境因素的雙重影響。遺傳性或獲得性補體旁路途徑無限制激活在aHUS發(fā)病中起主要作用。妊娠、感染、藥物、惡性高血壓、器官移植或自身免疫性疾病均可使遺傳易感個體補體級聯反應激活致aHUS發(fā)病[8]。補體級聯系統(tǒng)中相關的突變基因共有9個：補體H（CFH）、補體 I（CFI）、膜輔助蛋白（MCP）、B 因子（CFB）、C3、血酸調節(jié)素（THBD）、補體 H 相關基因（CFHR1-3）[6,9]。此外，抗CFH抗體產生是獲得性aHUS發(fā)病的原因。以上異常使補體旁路途徑調節(jié)失控、補體級聯激活、膜攻擊復合物形成，導致內皮細胞功能受損而起病。上述補體出現基因突變、基因組拷貝數變異、基因多態(tài)性等致補體調節(jié)異常是aHUS的主要遺傳機制[10]。aHUS呈常染色體顯性遺傳，為不完全外顯性，約50%的突變攜帶者表現外顯性[11-12]。其外顯率隨突變基因不同而有差異，CFH、MCP突變常表現出高度外顯性[13]。但是，仍約50%的aHUS患者未發(fā)現繼發(fā)性因素及補體異常[6]，需進一步增加對其病因及致病機制的認識和了解。

2013年，Lemaire等[14]通過對大量1歲以下的aHUS患兒進行基因測序，發(fā)現甘油二酯酰激酶ε（diacylglycerol kinase ε，DGKE）基因隱性突變是一種新型aHUS的重要發(fā)病機制。該aHUS特點是：發(fā)病年齡＜1歲，伴有蛋白尿甚至是腎病范圍蛋白尿，無致病性補體基因突變[14]。Lemaire等[14]認為，DGKE基因突變是不依賴于補體旁路途徑而致aHUS發(fā)病的一種獨立機制；而Sánchez Chinchilla等[15]認為補體異常和DGKE突變在致aHUS發(fā)病上具有相互作用，可引起足細胞結構受損、出現腎病性蛋白尿，部分患者可同時出現補體和DGKE異常，且補體異常可控制DGKE基因突變患者的發(fā)病及對治療的反應。本文旨在闡述上述兩種機制在aHUS發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 補體異常與aHUS

aHUS與補體旁路途徑過度激活相關。遺傳性和自身免疫性異常致旁路途徑無限制激活在補體介導的aHUS的關鍵作用已得到證實。遺傳性補體旁路途徑異常主要有2種類型：功能喪失突變如編碼CFH、CFI、MCP等的基因[16]，這些基因發(fā)生突變后，編碼的調節(jié)蛋白減少、調節(jié)功能降低，進而使CFH、CFI、MCP抑制補體激活的作用減弱，導致補體無限制激活；功能獲得突變如編碼C3、CFB等的基因，發(fā)生突變后可使補體旁路途徑C3轉化酶的生成增加，補體過度激活[3]。以上異常引起補體旁路途徑的級聯反應：小血管或毛細血管內皮細胞上大量C3b沉積、C3轉化酶形成，產生新的C3b分子；C3b分子和C3轉化酶結合形成C5轉化酶，進而裂解C5分子為C5a和C5b，最終形成膜攻擊復合物。這種級聯反應可嚴重損傷血管內皮細胞功能，使其失去抗血栓作用，引起血小板激活、纖維蛋白沉積及血栓形成堵塞靶器官的微血管腔。

CFH是補體旁路途徑最重要的調節(jié)蛋白，有20個短共有重復序列（SCRs）組成。N-末端SCRs1-4發(fā)揮免疫調節(jié)功能，C-末端SCRs 19-20能特異的結合在腎小球內皮細胞[17]。CFH基因突變在aHUS病例中約占20%～30%，以雜合突變?yōu)橹?。大部分突變患者血漿CFH水平正常，產生突變蛋白而失去調節(jié)功能。編碼CFH相關蛋白基因（CFHR1-5）在染色體上和CFH基因位置毗鄰，兩者具有高度的序列一致性，可發(fā)生非等位的同源重組（NAHR）使調節(jié)蛋白活性降低。重組基因在aHUS患者約占 3%～5%，CFH-CFHR1、CFH-CFHR3、CFHCFHR1-CFHR3的重組基因均有病例報道[18-20]?？笴FH抗體介導的aHUS約占5%～10%，在兒童病例中約占25%～50%。約 90%的 CFH抗體患者有 CFHR1和CFHR3基因純和缺失，導致相關蛋白缺陷。新的研究也提示，CHF抗體產生是由CFHR1基因突變或CFHR1/CFHR4基因共同缺失致CFHR1蛋白缺陷引起[21]。因此，CFHR1蛋白缺陷是導致CFH抗體產生的主要因素。

MCP是CFI裂解C3b、C4b分子的輔助因子，其基因突變約占10%～15%。約75%的MCP基因突變致MCP蛋白表達下降。CFI是一種絲氨酸蛋白酶，在輔助因子CFH、MCP的存在下，其功能是裂解C3b、C4b分子。CFI突變約占4%～10%，約50%的突變患者其蛋白分泌缺乏。C3、CFB基因功能獲得突變致C3轉化酶形成增加、補體激活失去限制。C3突變使C3b失去與調節(jié)蛋白結合的能力而不被降解，導致腎小球內皮細胞和血小板上C3轉化酶形成增加。CFB突變致B因子表達上調、C3轉化酶的穩(wěn)定性和活性增加且難以被CFH降解，最終導致補體旁路途徑持久性激活。THBD突變約占3%～4%，突變蛋白致C3b失活的作用減弱。

值得注意的是，約3%～12%的患者可能攜帶一種以上的補體突變基因（聯合基因突變）[22-24]。Bresin等[8]檢測了800例aHUS相關的補體突變基因發(fā)現，27例（3.4%）患者有聯合基因突變，而CFH、C3或CFB單基因突變就足以誘發(fā)aHUS；25%MCP或CFI突變的患者仍合并存在2個或3個其它致病基因突變。因此，Bresin等[8]認為補體基因突變增加了aHUS的易感性，但不直接導致aHUS的發(fā)生；并且，在不完全外顯性的前提下，單基因突變的aHUS其外顯性低于2個基因突變的aHUS，有2例患者攜帶3個突變基因表現為完全外顯性。單基因突變的患者，促發(fā)因素和aHUS的發(fā)病之間具有相關性[11-12，25]。

補體基因突變或抗CFH抗體引起的aHUS也可表現腎病性蛋白尿，且主要發(fā)生在兒童。1例CFH純合子突變的aHUS兒童患者，開始給予每周1次的血漿輸注治療，能成功控制病情，但是在治療第4年出現復發(fā)，并發(fā)展為腎病范圍蛋白尿[26]。138例由抗CFH抗體引起的aHUS中，81例（59%）患者在aHUS發(fā)病時即存在腎病范圍蛋白尿[27]。1例10歲攜帶K441R CFI突變體的aHUS患者，表現為持續(xù)的血小板減少性紫癜、貧血、腎功能衰竭和腎病范圍蛋白尿。該患者對血漿治療反應不佳，抗C5單克隆抗體治療后，腎功能恢復、尿蛋白減少[28]。綜上所述，足細胞也是補體介導aHUS的靶點，其損傷導致腎病性蛋白尿，多見于兒童aHUS患者。

2 DGKE突變與aHUS

Lemaire等[14]于2013年首次報道DGKE純和子或復合雜合子突變可引起一種特殊類型aHUS，且患者均不伴有補體成分異常，揭示了除補體旁路途徑異常以外致aHUS發(fā)病的新型遺傳機制。迄今為止，國外已報道多例DGKE基因隱性突變致aHUS發(fā)病病例。2對來自不同家族的兄妹，均在嬰兒期表現為aHUS，但沒有已知的補體突變基因或抗體。Lemaire等[14]通過檢測這4個aHUS患者的外顯子，證實了一個家族存在DGKE純和突變（p.Trp322*終止密碼前移），另一個家族存在DGKE復合雜合突變（p.Val153Serfs*3框移突變和p.Arg64Pro錯義突變）。此外，他們對47例兒科aHUS和26例成人aHUS患者的外顯子測序，證實了6例兒童患者存在DGKE純合子或復合雜合子突變，且均無補體異常；26例成人患者均未檢測到DGKE突變。Lemaire等[14]還發(fā)現在起病年齡＜1歲、無補體異常的aHUS患者中，DGKE突變約占27%（13/49）；在起病年齡＜1歲的aHUS家族中，DGKE突變約占50%（3/6）。其總結DGKE突變相關aHUS的臨床特點有:（1）均在1歲之前發(fā)病，這對有aHUS癥狀的嬰兒進行基因檢測具有指導意義；（2）5歲之前可多次復發(fā)；（3）即使離最后一次復發(fā)時間很長，在20歲之前多可發(fā)展為終末期腎??；（4）發(fā)展為腎病綜合征；（5）aHUS 發(fā)病后，即使腎功能恢復正常，大部分患者均表現為高血壓、血尿以及蛋白尿。

DGKE基因突變位點位于基因的外顯子序列。然而，Mele等[29]研究了2個家族（意大利/美國）的5例aHUS患者，發(fā)現DGKE內含子突變引起的aHUS。5例患者均是兒童期起病、遺傳原因不明。使用傳統(tǒng)的突變篩選參數對全部染色體及外顯子測序，意大利家族中未發(fā)現明顯的補體或DGKE外顯子突變；美國家族中僅有DGKE無義突變，而該突變并不致病。考慮到內含子突變可致外顯子的剪接異常，他們對內含子測序發(fā)現DGKE突變點位于內含子5區(qū)（c.888+40A＞G）。進而對意大利家族的2例aHUS兄妹的DGKE mRNA進行檢測，發(fā)現內含子5區(qū)突變致外顯子5區(qū)的剪接異常，形成了3種異常的mRNA，而缺乏野生型DGKE mRNA。其中一種mRNA較野生型DGKE mRNA多39個核苷酸，其指導翻譯的DGKE蛋白比正常多13個氨基酸，從而影響DGKE活性而致病。此外，美國家族的3例aHUS兄妹也存在DGKE非編碼區(qū)的復合雜合子突變。并且這2個家族的患者均具有DGKE相關aHUS典型臨床特點：1歲之前起??；多次復發(fā)；表現為蛋白尿。這是第1例關于DGKE內含子突變致aHUS發(fā)病的報道，因此DGKE外顯子序列、內含子序列突變均可導致aHUS發(fā)病，且均無補體成分異常。在治療反應上，2例DGKE突變相關aHUS患者分別接受抗C5單克隆抗體和輸注新鮮冰凍血漿后出現復發(fā)，3例患者接受尸體腎移植，均未出現移植后復發(fā)情況，僅1例在6年后因慢性排斥反應導致失功。而移植后復發(fā)在補體缺陷相關aHUS患者中很常見，不予抗補體治療常引起移植失敗。因此，治療反應也提示DGKE基因突變是區(qū)別于補體異常致aHUS的新機制[14]。

然而，近期研究發(fā)現aHUS患者可同時存在DGKE突變和補體系統(tǒng)異常，并且兩者之間具有相互作用。2013年，Westland等[30]報道了2例DGKE截短突變相關aHUS姐弟患者在隨訪中均表現為持續(xù)性低C3血癥，提示存在補體系統(tǒng)激活與消耗。2014年，一項納入83例發(fā)病年齡＜2歲aHUS患者的隊列研究發(fā)現：4例存在DGKE突變（1例純和突變，3例雜合突變），其中3例患者同時伴有雜合子THBD或C3突變[15]。4例患者中，2例并發(fā)DGKE突變及THBD突變的患者，血漿輸注療法可控制復發(fā)并避免腎功能衰竭；1例并發(fā)DGKE突變和C3突變的患者，血漿輸注療法可使血液指標恢復正常，抗C5單克隆抗體治療使水腫減輕；1例僅有DGKE突變的患者，未行血漿輸注或抗C5單克隆抗體治療，腎功能即恢復正常[15]。該研究提示補體基因突變可影響DGKE突變患者對治療的反應。

DGKE突變如何導致aHUS目前尚無結論。DGKE是甘油二酯酰激酶（DGK）家族成員，能使富含花生四烯酸的甘油二酯（DAG）磷酸化為磷脂酸（PA），從而阻斷依賴DAG的蛋白激酶C（PKC）系統(tǒng)。DGKE表達于內皮細胞、血小板，這兩者是參與血凝塊形成的主要細胞。當DGKE缺陷時，大量DAG不能被轉化為PA而堆積，堆積的DAG可通過激活PKC，促發(fā)細胞內DAG-PKC信號通路，引起內皮細胞及血小板促血栓因子上調、血小板激活，血栓形成。

此外，DGKE還存在于足細胞，已有報道DGKE突變患者表現有腎病綜合征、足細胞骨架改變及足突融合[31]。3例DGKE純和突變的土耳其患者，表現為大量蛋白尿和低白蛋白血癥，并有不同程度腎功能不全，腎臟病理表現符合腎小球微血管?。▋绕ぜ毎軗p、腫脹、毛細血管腔閉塞，但也伴有雙軌征、足細胞足突融合等膜增生性腎小球腎炎的表現[32]。aHUS存在足細胞損傷，局部C5b-9形成可致足細胞溶解：亞溶解型C5b-9通過釋放蛋白酶、增加生長因子和活性氧等物質致足細胞結構功能受損，還可引起DNA損傷，從而限制足細胞增生和修復，并可增加足細胞上TRPC6表達，導致鈣內流增加[33]。TRPC6是鈣通透性陽離子通道，其功能與足細胞骨架有關。當TRPC6表達增加，細胞內鈣離子濃度增加，可導致足細胞骨架重排，產生蛋白尿。TRPC6活性與DAG有關，后者通過激活PKC促使TRPC6通道開放[34]。DGKE缺陷時，大量DAG激活DAG-PKC信號通路而活化TRPC6，促使鈣離子內流增加，致足細胞骨架改變、足突融合，出現蛋白尿甚至腎病性蛋白尿。

3 小結

補體途徑異常和DGKE突變均可激活細胞內的DAG-PKC信號通路，進而導致血小板激活、血栓形成，并可致足細胞損傷和蛋白尿產生。同時，C5b-9聚集可激活DAG-PKC通路，增加細胞內鈣離子濃度，并可增強胞質磷脂酶A2活性產生大量花生四烯酸，后者通過環(huán)氧化酶生成前列腺素E2和血栓素A2。因此，補體激活產物可改變DGKE的調節(jié)途徑，使得兩者在發(fā)病機制上相互關聯，這對于進一步了解aHUS的發(fā)病機制具有積極的意義。