成熟液成分對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)影響的研究進(jìn)展

王 晨，王浩晨，周雪雁

（1．西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2．浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，杭州 310058）

卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟為動物人工輔助生殖領(lǐng)域拓寬了前景，體外受精、核移植、器官移植等胚胎工程技術(shù)的研究和應(yīng)用越來越廣泛，卵母細(xì)胞體外培育的質(zhì)量是決定胚胎生物工程研究和應(yīng)用成敗的關(guān)鍵因素之一，但至今卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的效果仍然不穩(wěn)定［1］。 朱平川等［2］研究發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基對卵母細(xì)胞體外發(fā)育有重要影響，趙曉娥等［3］研究發(fā)現(xiàn)很多生長因子對卵母細(xì)胞體外發(fā)育率有不同的影響。

1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

TCM199是目前卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中使用最廣泛的一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，TCM199中培養(yǎng)的綿羊卵母細(xì)胞形態(tài)良好，極適宜進(jìn)行下一步試驗(yàn)。在綿羊體外受精的TCM199漸變培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)利用TCM199體外受精漸變培養(yǎng)體系的試驗(yàn)組和對照組成熟率差異不顯著，但是能顯著提高綿羊卵母細(xì)胞體外受精后的卵裂率和桑囊率。在小鼠卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)研究中，M2和M16培養(yǎng)液均為實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)細(xì)胞的常用試劑，其中M2培養(yǎng)液是由M16培養(yǎng)液改進(jìn)而來，由于兩者所用的緩沖液不同，導(dǎo)致兩者培養(yǎng)液具有不同的pH。M2培養(yǎng)液微偏酸性，M16培養(yǎng)液微偏堿性。經(jīng)試驗(yàn)研究表明，在運(yùn)用M2和M16兩種不同培養(yǎng)液進(jìn)行小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)時，M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)成熟率明顯高于M2培養(yǎng)液中培養(yǎng)成熟率［2］。

2 動物血清對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加動物血清是動物細(xì)胞體外培養(yǎng)中最重要的一部分，動物血清對卵母細(xì)胞成熟有著至關(guān)重要的作用，可能與動物血清中化學(xué)成分尚不明確的諸多生長因子有關(guān)。唐業(yè)剛等［4］研究得到成熟液中添加血清與否對卵母細(xì)胞體外成熟率無明顯影響，但是含有血清的培養(yǎng)液中的卵母細(xì)胞隨后的受精卵顯著高于無血清組。有研究者認(rèn)為血清的來源動物種類以及動物所處時期對卵母細(xì)胞培養(yǎng)有一定影響，尤其是發(fā)情期動物的血清。發(fā)情3 d羊血清對綿羊體外受精卵裂率囊胚率有明顯提高，故發(fā)情3 d的綿羊血清更適合綿羊的體外受精。原因可能是因?yàn)榘l(fā)情期的綿羊血清中含有大量的FSH等激素。

唐業(yè)剛等［4］認(rèn)為血清并非水牛卵母細(xì)胞體外細(xì)胞成熟所必需，其采用EH和6DMAP聯(lián)合處理也可達(dá)到卵母細(xì)胞成熟的效果，且與加血清組成熟率無顯著性差異。張立蘋等［5］研究發(fā)現(xiàn)添加PVA的成熟液培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞成熟率與血清（FBS）組無顯著性差異，故可以用PVA代替FBS。但是在使用EH或PVA代替血清時都需添加或大量添加細(xì)胞生長所需的激素與生長因子。

3 激素對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

激素作為動物卵母細(xì)胞體內(nèi)外培養(yǎng)的研究重點(diǎn)，許多研究者已經(jīng)證明，促性腺激素能夠促進(jìn)哺乳動物卵母細(xì)胞的體外成熟，促卵泡生成素（FSH）和黃體生成素（LH）是卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟液中最常用的2種促性腺激素，還有研究者發(fā)現(xiàn)用雄二醇E2和孕馬血清促性腺激素PMSG也可在體外促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。

FSH和LH是由垂體分泌的兩種促性腺激素（Gn）。在正常的排卵周期中，F(xiàn)SH和LH協(xié)同發(fā)揮作用，對調(diào)控卵泡生長、卵母細(xì)胞成熟、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌產(chǎn)生重要影響。研究表明FSH可以誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，這是卵母細(xì)胞成熟的前提條件。FSH能促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖分化、向外擴(kuò)展并刺激卵丘細(xì)胞產(chǎn)生一種能促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子。FSH還能克服一定濃度Hx、IBMX、dbcAMP等對綿羊卵母細(xì)胞成熟的自發(fā)抑制，誘導(dǎo)綿羊卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂成熟。

張濤等［6］研究表明，LH對山羊卵母細(xì)胞的體外成熟有一定的促進(jìn)作用。目前的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)中大多為FSH、LH聯(lián)合使用，經(jīng)試驗(yàn)得到成年母羊（牛）卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)時，在成熟液中添加濃度為10．0 ug／mL的FSH和LH，成熟率明顯提高。

4 生長因子對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

大量的試驗(yàn)證明在動物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中，尤其是在無血清的動物卵母細(xì)胞培養(yǎng)成熟液中添加適量生長因子對卵母細(xì)胞成熟以及早期胚胎發(fā)育有重要作用。所添加的生長因子大多數(shù)是動物血清中所含有的物質(zhì)，如 EGF（表皮生長因子）、IGF－I（胰島素樣生長因子－I）、GDNF（神經(jīng)膠質(zhì)源營養(yǎng)因子）、LIF（白血病抑制因子）、SCF（干細(xì)胞因子）、VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）等，這些生長因子對卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)有極大影響。

EGF（表皮生長因子）是一種局部調(diào)節(jié)因子，存在于動物體的體液和組織中，具有生物學(xué)的作用。有眾多研究指出，EGF有促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的作用，魯進(jìn)等［7］研究發(fā)現(xiàn)添加EGF的成熟液培養(yǎng)山羊卵母細(xì)胞的成熟率有所提高，但是添加量在30 μg／L以下對山羊卵母細(xì)胞體外成熟無顯著性影響。IGF－I可以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞LH受體的表達(dá)，但是在趙曉娥等［3］的研究中顯示培養(yǎng)液中添加IGF－I后山羊卵母細(xì)胞成熟率明顯高于對照組，尤其是EGF和IGF－I的聯(lián)合使用，顯著高于對照組卵母細(xì)胞成熟率。

GDNF、LIF和SCF在動物卵母細(xì)胞培養(yǎng)中一般為聯(lián)合使用，研究表明GDNF、LIF和SCF對山羊卵母細(xì)胞體外成熟有顯著影響，單獨(dú)使用SCF、LIF、GDNF濃度分別為 10、10、15 IU／mL時山羊卵母細(xì)胞成熟率最高。當(dāng)三者聯(lián)用和GDNF＋LIF組效果最好，山羊卵母細(xì)胞成熟率均高于單獨(dú)使用或其他兩兩組合的成熟率。

5 抗生素對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

抗生素作為一類抗菌性藥物廣泛用于預(yù)防和治療人類和動物疾病，在動物細(xì)胞培養(yǎng)中為了降低細(xì)胞受到污染而停止生長甚至死亡的發(fā)生被廣泛使用，目前主要使用的為青霉素、鏈霉素與離子霉素。多數(shù)研究者利用添加50 IU／mL青霉素與50 μg／mL鏈霉素的成熟液培養(yǎng)綿羊卵母細(xì)胞。

目前暫未出現(xiàn)青霉素、鏈霉素濃度對卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟率的研究結(jié)果，但是譚景和等［8］研究表明，高濃度（100 IU／mL）的青霉素可大大降低卵母細(xì)胞的孤雌活化率，但是適當(dāng)濃度（50 IU／mL）的青霉素可使活化率出現(xiàn)一個峰值，故推測高濃度的青霉素可能使其成熟率降低，但是適量青霉素濃度會使其出現(xiàn)一個最大值。

雖然抗生素可有效避免污染的產(chǎn)生，但是抗生素并不是正常動物機(jī)體內(nèi)環(huán)境中所含有的物質(zhì)，添加抗生素會使體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞的環(huán)境與正常環(huán)境有所差別，且在添加抗生素的情況下卵母細(xì)胞的成熟率是否會發(fā)生改變均有待考證。

6 含巰基化合物對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

GSH（巰基乙胺）在動物細(xì)胞中有抗氧化和減少損傷的作用，在成年動物卵母細(xì)胞中GSH含量的增加發(fā)生在排卵前，并且羔羊卵母細(xì)胞合成GSH能力顯著低于成年羊。由此推測在成熟液中添加含巰基化合物（如胱氨酸、半胱氨酸、巰基乙胺和β－巰基乙醇）能夠提高細(xì)胞中GSH濃度，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞成熟率。研究顯示，添加100μmol／L巰GSH能顯著提高羔羊卵母細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的成熟能力。雖然成熟液中添加β－巰基乙醇對羔羊卵母細(xì)胞成熟率、胚胎卵裂率影響不顯著，但是對囊胚率影響極顯著。

7 展望

動物卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)是一個極其復(fù)雜的過程，其影響因素不僅僅局限于動物卵母細(xì)胞培養(yǎng)成熟液的成分，其成熟還與樣品來源動物的品種、采樣年齡、采卵方式和采卵季節(jié)有關(guān)，且卵泡的直徑大小對動物卵母細(xì)胞體外成熟也有影響。應(yīng)該如何建立更加完善的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境體系進(jìn)而模擬出與動物機(jī)體內(nèi)卵母細(xì)胞所處環(huán)境，對提高卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟率和推動動物胚胎工程發(fā)展的進(jìn)程有舉足輕重的作用。

［1］岑 文．豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)及孤雌胚胎體外培養(yǎng)的研究［D］．西安：陜西師范大學(xué)，2015．

［2］朱平川，肖 艷．卵巢低溫保存時間與不同培養(yǎng)液對小鼠卵母細(xì)胞體外發(fā)育的影響［J］．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（11）：221－223，289．

［3］趙曉娥，李向臣，高立功，等．山羊卵母細(xì)胞的體外成熟研究［J］．中國農(nóng)學(xué)通報，2005（9）：1－3，16．

［4］唐業(yè)剛，李躍民，武建中，等．血清對水牛卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精及早期胚胎發(fā)育的影響［J］．動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005（11）：98－101．

［5］張立蘋，王亞剛，李 莉，等．成熟液中不同添加物對豬卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚胎發(fā)育的影響［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（10）：2502－2505．

［6］張 濤，劉 超，呂麗華．LH和hCG對山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響［J］．畜禽業(yè)，2009（4）：40－42．

［7］魯 進(jìn)，劉鳳軍，王勇勝，等．EGF和IGF－1對山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響［J］．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005（3）：7－9．

［8］譚景和，秦鵬春，馬 驥．卵齡和培養(yǎng)液中青霉素濃度對小鼠卵母細(xì)胞酒精孤雌活化效果的影響［J］．細(xì)胞生物學(xué)雜志，1988（2）：69－72，98．