PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的運(yùn)用

□ 劉 杰 陳 璐 華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司

微生物的含量在食品安全中有十分重要的作用，在近些年來，一些地方環(huán)境的污染導(dǎo)致原生的食物中含有一定量的污染成分，直接導(dǎo)致食品安全受到影響。在這些食品當(dāng)中，存在的有害菌群遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出允許范圍值，甚至有些食物中存在微量的致病微生物[1]。食品安全和每個(gè)人的切身利益息息相關(guān)，是群眾最為關(guān)心的民生問題之一，強(qiáng)化對(duì)食品的微生物檢測(cè)工作既專業(yè)又有必要性。本文結(jié)合我國(guó)近年來在微生物的檢測(cè)中做出的努力，深入探討PCR技術(shù)如何在食品安全中起到把關(guān)的作用。

1 微生物檢測(cè)的發(fā)展情況

我國(guó)的法律已經(jīng)明確了對(duì)食品藥品的檢驗(yàn)方式，在食品的檢測(cè)中對(duì)微生物的檢測(cè)有著嚴(yán)格的限定和標(biāo)準(zhǔn)。在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定下，檢測(cè)人員根據(jù)相應(yīng)的物理和化學(xué)指標(biāo)對(duì)食品進(jìn)行抽樣檢測(cè)。根據(jù)微生物的菌群種類和含量進(jìn)行比對(duì)區(qū)分，用檢測(cè)的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)相互對(duì)照，判定食品的質(zhì)量，并且認(rèn)定是否能夠食用。但是，在日常的檢測(cè)中常出現(xiàn)檢測(cè)人員難以達(dá)到技術(shù)要求、檢測(cè)儀器滿足不了認(rèn)定要求和對(duì)微生物種類判定存在疑問的情況。首先是在現(xiàn)有的條件下，能夠具有較高專業(yè)素質(zhì)和檢測(cè)水平的人員數(shù)量與實(shí)際需求數(shù)量相差較大。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，要求檢測(cè)人員工作細(xì)心，且能夠在檢測(cè)過程有較強(qiáng)的責(zé)任心，這對(duì)檢測(cè)人員的素質(zhì)有較高的要求。實(shí)驗(yàn)室處于無菌的環(huán)境，任何的失誤和違規(guī)動(dòng)作都會(huì)給試驗(yàn)結(jié)果帶來不同的結(jié)果，直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不真實(shí)、不可信[2]。此外，在檢測(cè)中儀器的使用也是關(guān)鍵因素。按照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)儀器進(jìn)行定期的標(biāo)定和校準(zhǔn)，準(zhǔn)備詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)儀器相關(guān)參數(shù)信息，以備在實(shí)驗(yàn)中隨時(shí)使用，定期對(duì)儀器進(jìn)行保養(yǎng)維護(hù)。尤其需要注意的是在極溫環(huán)境下的儀器養(yǎng)護(hù)，過高溫度、過低溫度、濕度過大或者干燥的環(huán)境都要保證精密儀器的恒溫恒壓恒濕環(huán)境，這樣才能保證儀器使用準(zhǔn)確。對(duì)于微生物種類的判斷也是檢測(cè)的關(guān)鍵一環(huán)，每種微生物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和菌落培養(yǎng)方式不同，利用菌落的采集和稀釋，得到培養(yǎng)基中的菌落成分。但是流程如此，在操作中就存在很多不方便之處，必須要求在操作過程中強(qiáng)化監(jiān)督管理，確保流程合規(guī)。在傳統(tǒng)的食物微生物檢測(cè)中還是有很多的操作不足之處，使用PCR可以在很大程度上解決這些問題。

2 PCR技術(shù)的推廣使用

2.1 在大腸桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用

大腸桿菌作為食物中常見的菌類對(duì)人體危害較大，同時(shí)大腸桿菌的繁殖能力強(qiáng)，在有一定培養(yǎng)基礎(chǔ)下都能進(jìn)行大量繁殖。在傳統(tǒng)的檢測(cè)中，對(duì)于大腸桿菌較難檢測(cè)出準(zhǔn)確的數(shù)值。在使用PCR技術(shù)中，根據(jù)多重的篩選辨別后，利用賀毒素的靶向基因序列，對(duì)大腸桿菌的溶血細(xì)胞因子和多糖結(jié)構(gòu)分子進(jìn)行靶向標(biāo)定。經(jīng)過免疫的化學(xué)反應(yīng)，最終得到多基因的類大腸桿菌，實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)采集食物中的不同大腸桿菌數(shù)量，形成0157∶H7的比對(duì)基因序列，達(dá)到找尋大腸桿菌基因序列的目的，再使用血清法的比對(duì)參考，最終用PCR技術(shù)得到更為精確的檢測(cè)結(jié)果[3]。

2.2 在幽門螺桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用

幽門螺桿菌對(duì)人體的胃環(huán)境有較大的危害，長(zhǎng)期菌群指標(biāo)超標(biāo)對(duì)胃黏膜有很強(qiáng)的迫害性。使用多重環(huán)境下的PCR技術(shù)，可以對(duì)螺桿菌的血清進(jìn)行比對(duì)鑒定，對(duì)于基因中的脫氧核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，利用異性基因的引物效應(yīng)，重新構(gòu)建新的PCR環(huán)境，在檢測(cè)的比選中，根據(jù)多重的PCR技術(shù)和一重PCR技術(shù)相互對(duì)比，在兩者出現(xiàn)較為明顯的差異性時(shí)，可以判斷出此時(shí)的菌類含量較高，食物不滿足食用的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)兩者比對(duì)相近時(shí)，利用基因的靈敏性研究結(jié)論，可以知道幽門螺桿菌處于靜止未擴(kuò)散的情況。利用此方式可以將禽類活體中的螺桿菌標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽性，則表示實(shí)際情況與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，但是出現(xiàn)陰性，實(shí)驗(yàn)指標(biāo)會(huì)發(fā)生調(diào)整。根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，利用PCR檢測(cè)標(biāo)記的菌類有更高的準(zhǔn)確率。

2.3 在金色葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用

金色葡萄球菌常常出現(xiàn)在蔬菜和水果當(dāng)中，這類致病菌類在經(jīng)過變異之后，一般農(nóng)藥很難殺除，而且在一般環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生大量的繁殖，繁殖后產(chǎn)生SE類型的毒素，這類毒素給人帶來最為直接的后果就是造成食物中毒。利用基因環(huán)境下的PCR檢測(cè)技術(shù)，可以在蔬果中直接檢測(cè)到金色葡萄球桿菌，利用線性核糖核酸的耐熱酶效應(yīng)，轉(zhuǎn)為常規(guī)的基因序列，在免疫的條件下對(duì)菌類進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)不同菌類的靈敏度和特異度，從而實(shí)現(xiàn)PCR檢測(cè)的真實(shí)性。在實(shí)際的操作中，PCR檢測(cè)可以將檢測(cè)的準(zhǔn)確度控制在正負(fù)

1 pg的范圍內(nèi)。

2.4 在乳酸菌檢測(cè)中的應(yīng)用

乳酸菌是一種非致病菌，可生長(zhǎng)在真空環(huán)境中。應(yīng)用PCR 檢測(cè)真空包裝中的微生物可以明確食品腐敗與否，影響到食品食用安全。有研究人員采用rRNA ISR 與16S rRNA 構(gòu)建出PCR對(duì)真空包裝中的牛肉相關(guān)腐敗乳酸菌進(jìn)行檢測(cè)，還有檢測(cè)人員使用變性梯度凝膠電泳法檢測(cè)，得到的結(jié)果一致。均證明了隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)檢出率提高。實(shí)驗(yàn)過程構(gòu)建出了PCR 有著較好的重復(fù)性，且解決了rRNA 不能重復(fù)檢測(cè)泡菜中乳酸菌的問題。

3 PCR技術(shù)改進(jìn)技術(shù)

在使用PCR技術(shù)過程中，對(duì)于微生物的環(huán)境要加以控制，包括在微生物的檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)用品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)都要嚴(yán)格遵照國(guó)家規(guī)范進(jìn)行，以保證后期檢驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。在實(shí)驗(yàn)的過程中，利用PCR技術(shù)對(duì)質(zhì)量的控制要使得結(jié)果和實(shí)驗(yàn)的操作相互對(duì)應(yīng)，嚴(yán)格要求無菌環(huán)境下的比對(duì)基因方式。在此基礎(chǔ)上衍生出PCR相關(guān)改良技術(shù)，對(duì)微生物的檢測(cè)同樣達(dá)到很好的檢測(cè)效果。

實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)，是將熒光基團(tuán)加到PCR 反應(yīng)系統(tǒng)中，運(yùn)用熒光信號(hào)積累，對(duì)整個(gè)PCR 過程實(shí)時(shí)檢測(cè)，最后用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量未知模板，這種方法就叫實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)。該法是在完全閉管情況下檢測(cè)，而且結(jié)合此檢測(cè)技術(shù)以及平穩(wěn)無干預(yù)的熒光激發(fā)光源，在PCR 后不需再進(jìn)行處理，有效防止交叉?zhèn)魅?。該法運(yùn)用縮短了檢測(cè)周期，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)能做到準(zhǔn)確、特異。給食品加工時(shí)檢測(cè)外源DNA 受到污染的定量，在檢測(cè)病原微生物、檢測(cè)摻假量以及檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食物等方面起到了有效作用。

4 結(jié)語

利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌的方式發(fā)展迅速，尤其是PCR技術(shù)及在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來的眾多新技術(shù)，可以使檢測(cè)成本降低，效率更高，準(zhǔn)確度更高。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法檢測(cè)致病菌需要經(jīng)過生化和血清學(xué)等多個(gè)步驟，操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，靈敏度低，并且傳統(tǒng)方法無法檢測(cè)難以人工培養(yǎng)的微生物。PCR 反應(yīng)的最大特點(diǎn)是擴(kuò)增效率高和靈敏度高。本文還對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)要的介紹，利用防止交叉感染的方式在避免出現(xiàn)污染的情況下有效地彌補(bǔ)了基礎(chǔ)PCR技術(shù)在使用中的不足之處，更好地發(fā)揮PCR在食品微生物的檢驗(yàn)效果。

[1]江飛,張旭偉.PCR 技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用和發(fā)展[J].河南農(nóng)業(yè)2017(6):156-157.

[2]李富威,張舒亞,曾慶坤,等.乳制品中水牛乳成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)[J].2013(2):247-252.

[3]胡博.PCR 技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代食品,2017(4):36-37..