莊連婷,黃瑛
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院超聲科,沈陽(yáng) 110004)
超聲波成像技術(shù)是利用對(duì)掃描聲束反射信號(hào)的接收、處理以獲取人體內(nèi)器官的影像,是一種無(wú)創(chuàng)、安全、可靠的成像方式。但由于超聲波易受腸氣、肺氣和骨骼等因素干擾,會(huì)導(dǎo)致圖像質(zhì)量不佳。因此,尋找一種能夠提高血池顯像分辨率、顯示組織灌注的成像方法是很多研究者的愿望。20世紀(jì)60年代,美國(guó)GRAMIAK等[1]首次提出“超聲造影”的概念,超聲造影技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了超聲血池顯像的分辨率,而超聲造影技術(shù)的關(guān)鍵在于超聲造影劑的研究制備。
迄今為止,有關(guān)超聲造影劑的研究已經(jīng)有半個(gè)世紀(jì)之久,超聲造影劑的發(fā)展主要經(jīng)歷了3個(gè)階段。第一代超聲造影劑為游離氣體,由于其穩(wěn)定性差、不能由外周靜脈注射,只能用于右心顯影,很少應(yīng)用;第二代超聲造影劑為由蛋白質(zhì)或多糖包裹自由氣體的微泡,不僅能經(jīng)外周靜脈注射入人體,還通過(guò)肺循環(huán)實(shí)現(xiàn)左心和外周血管顯影,實(shí)現(xiàn)了造影劑由有創(chuàng)到無(wú)創(chuàng)質(zhì)的飛躍;第三代造影劑為由脂質(zhì)或者多聚化合物包裹大分子惰性氣體的微泡造影劑[2],其中大分子惰性氣體多為氟碳?xì)怏w,粒徑通常為1~10 μ m,由于其溶解度和彌散度低,體內(nèi)存留時(shí)間長(zhǎng),顯影效果好,生物安全性高和相容性好,現(xiàn)已有部分第三代超聲造影劑通過(guò)食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and Drug Administration,F(xiàn)DA) 審核應(yīng)用于臨床,如Sonovue、Definity、Optison等。
第三代超聲微泡造影劑的微泡大小是微米級(jí),與紅細(xì)胞差不多大,而腫瘤新生血管的內(nèi)皮間隙約為380~780 nm,因此微米級(jí)超聲微泡造影劑無(wú)法通過(guò)腫瘤血管間隙實(shí)現(xiàn)腫瘤血管顯像,僅能用于血池顯像;即使將微米級(jí)微泡注射入實(shí)體腫瘤中,也不能離開(kāi)脈管系統(tǒng),反而會(huì)引起相應(yīng)的血管和淋巴管引流不暢。隨著超聲分子影像學(xué)的迅速發(fā)展和臨床需求的增加,超聲造影劑從微米級(jí)微泡發(fā)展到納米粒,微泡管徑更小、穿透力更強(qiáng),可以穿過(guò)腫瘤血管間隙進(jìn)入組織[3]。本文主要就靶向納米粒超聲造影劑的研究進(jìn)展做一綜述。
納米粒超聲造影劑的物理屬性與其外膜和內(nèi)核構(gòu)成密切相關(guān)。
根據(jù)內(nèi)核的形態(tài)不同,分為納米級(jí)微泡和納米乳超聲造影劑。納米級(jí)微泡超聲造影劑與第三代超聲造影劑構(gòu)成基本相同,都是由脂質(zhì)或者多聚化合物包裹大分子惰性氣體組成;納米粒超聲造影劑經(jīng)微米級(jí)超聲微泡造影劑差速離心法得到[4],粒徑約為490 nm,性質(zhì)穩(wěn)定,低溫避光保存其粒徑和性能可維持達(dá)2周;兩者不同之處僅是粒徑達(dá)到納米級(jí),穿透力更強(qiáng),能進(jìn)入腫瘤血管間隙。
與第三代超聲造影劑不同之處,納米乳超聲造影劑的內(nèi)核為氟代氫的脂肪族化合物,其中碳原子數(shù)量決定全氟碳的物理屬性,碳原子數(shù)<5為氣態(tài),≥5為液態(tài);納米乳超聲造影劑內(nèi)核全氟碳的碳原子數(shù)≥5。但全氟戊烷[5]的沸點(diǎn)為29 ℃,注入人體生理狀態(tài)下即相變?yōu)闅鈶B(tài),這與超聲聚焦特定部位顯像相矛盾,因此目前研究使用較多的內(nèi)核為全氟己烷或過(guò)氟辛基溴。全氟己烷和過(guò)氟辛基溴沸點(diǎn)高,雖能克服上述存在的問(wèn)題,但又出現(xiàn)需要更高能量的超聲波促使液氣相變發(fā)生這一問(wèn)題。有學(xué)者[6]發(fā)現(xiàn)用氧化鐵納米顆粒作為成核位點(diǎn),對(duì)高沸點(diǎn)的全氟碳進(jìn)行改性,可以大大降低納米液滴的沸點(diǎn),從而解決這一問(wèn)題。
納米粒超聲造影劑根據(jù)外膜材料不同,分為脂質(zhì)納米粒超聲造影劑、高分子納米粒超聲造影劑、液態(tài)氟碳納米粒等。脂質(zhì)納米粒超聲造影劑是目前研究較成熟的納米粒超聲造影劑,其外膜多為磷脂。磷脂在人體內(nèi)穩(wěn)定性好,能夠靶向多種炎癥標(biāo)志物,如抗細(xì)胞黏附分子1、抗血管黏附分子1、抗纖維蛋白、抗纖維蛋白原以及抗組織因子等。李碩陽(yáng)等[7]制備了一種載小干擾RNA的脂質(zhì)納米級(jí)超聲微泡造影劑,平均粒徑約為400 nm。利用脂質(zhì)納米粒超聲造影劑可以對(duì)腫瘤組織顯像,小干擾RNA可以促使腫瘤細(xì)胞凋亡,使腫瘤基因沉默,實(shí)現(xiàn)腫瘤治療評(píng)估一體化。
高分子納米粒超聲造影劑[8-9]是一種新型超聲造影劑,其外膜多為乳酸/羥基乙酸聚合物,乳酸/羥基乙酸聚合物是目前唯一通過(guò)FDA審核的外膜高分子材料。駱杰等[10]制備一種載紫杉醇和赫賽汀的高分子納米級(jí)超聲微泡造影劑;將其引入乳腺癌細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)與MCF-7有良好的結(jié)合性,這為實(shí)現(xiàn)乳腺癌超聲分子顯像和靶向治療奠定了基礎(chǔ)。
液態(tài)氟碳納米粒[11]是目前報(bào)道最多的多功能納米粒超聲造影劑,集成像和治療于一體;其核心為較穩(wěn)定的氟碳類液體,液體成分使其對(duì)壓力和機(jī)械應(yīng)力更具有抵抗性,外殼為可連接配體的脂質(zhì)或高分子材料;當(dāng)其游離于血液循環(huán)中未到達(dá)靶區(qū)前,背向散射回聲極低,只有聚集于靶區(qū)時(shí),超聲信號(hào)才明顯增強(qiáng),降低背景噪聲,提高對(duì)比信號(hào);液態(tài)氟碳納米粒平均粒徑約為200 nm,體內(nèi)穩(wěn)定性好,循環(huán)半衰期較長(zhǎng)。
常規(guī)超聲造影劑對(duì)特定部位沒(méi)有特異靶向性,包括納米粒超聲造影劑,然而靶向納米粒超聲造影劑可以對(duì)特定部位靶向結(jié)合,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)顯像。有文獻(xiàn)[3]表明,雖然靶向微米級(jí)超聲微泡造影劑也具有靶向性,但是腫瘤新生血管間隙小、靶點(diǎn)有限,這就推動(dòng)了靶向納米粒超聲造影劑的問(wèn)世。靶向納米粒超聲造影劑是繼游離氣體、包裹自由氣體的白蛋白或多糖微泡和包裹全氟化碳等惰性氣體的傳統(tǒng)微泡之后的一種新型超聲造影劑[4],其表面連接有針對(duì)特定組織特異性受體的配體或是針對(duì)特異性抗原的抗體,納米粒到達(dá)靶區(qū)后可特異地與病灶相應(yīng)受體結(jié)合,使特定病變部位的超聲信號(hào)增強(qiáng),從而實(shí)現(xiàn)超聲在分子水平的實(shí)時(shí)精準(zhǔn)顯像。
靶向納米粒超聲造影劑有2種顯像機(jī)制[12],即被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向。由于腫瘤血管的高滲透性增強(qiáng)了滲透性和保留率效應(yīng),納米粒有更多可能積聚在腫瘤中,這種結(jié)合方式稱為被動(dòng)靶向;靶向納米粒超聲造影劑外殼上的特異性配體與腫瘤組織受體特異性結(jié)合稱為主動(dòng)靶向。
2.2.1 惡性腫瘤化療藥物的傳遞:自1997年以來(lái),人們一直在研究超聲造影劑介導(dǎo)的藥物傳遞,目前最新的研究方向是靶向納米粒超聲造影劑介導(dǎo)的藥物傳遞。傳統(tǒng)的藥物治療在對(duì)病灶起作用的同時(shí)會(huì)對(duì)病灶周圍正常組織產(chǎn)生影響,導(dǎo)致不良反應(yīng),影響正常組織功能;而靶向納米粒超聲造影劑不僅能夠準(zhǔn)確到達(dá)特定組織或特定部位實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)顯像,還能提高藥物的傳遞效率。靶向納米粒超聲造影劑介導(dǎo)藥物傳遞的作用基礎(chǔ)是超聲波引導(dǎo)納米粒形成細(xì)胞膜孔隙、打開(kāi)細(xì)胞間連接或內(nèi)吞作用以促進(jìn)藥物吸收[5]。靶向納米粒超聲造影劑介導(dǎo)的藥物傳遞主要用于惡性腫瘤的化療方面。
化療是一種全身性治療方式,能夠阻止癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,直至最終消滅癌細(xì)胞,其中化療藥的固有毒性對(duì)消滅癌細(xì)胞至關(guān)重要,但這也是產(chǎn)生不良反應(yīng)的主要原因;而減少不良反應(yīng)的一種方法就是將化療藥封裝在漏出率很低的載體上,同時(shí)載體具有在腫瘤組織內(nèi)迅速釋放化療藥的能力,從而減少健康的組織暴露。而設(shè)計(jì)一種具有這2種對(duì)立屬性的載體是實(shí)現(xiàn)藥物傳遞的主要挑戰(zhàn)。將特定部位的載體由穩(wěn)定的循環(huán)狀態(tài)觸發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定的釋放狀態(tài)的方法有很多種,可以通過(guò)超聲波爆裂脂質(zhì)體和細(xì)胞膜 (聲致相變[13]) ,也可以通過(guò)一定能量的激光輻照發(fā)生液氣相變 (光致相變[13]) ,還可以通過(guò)制備一種內(nèi)部含有全氟戊烷等氟碳液體的磁性納米粒,外加交變磁場(chǎng)使磁性成分產(chǎn)熱,使液態(tài)氟碳發(fā)生液氣相變 (磁致相變[13]) 。以上3種方法都能夠使特定部位的載體快速釋放藥物,并使其進(jìn)入附近的細(xì)胞,同時(shí)超聲波的緊密聚焦能力能精確地監(jiān)控腫瘤組織位置,從而實(shí)現(xiàn)了超聲成像和治療一體化。
前列腺癌治療方案中使用的阿霉素 (doxorubicin,DOX) 是一種細(xì)胞非特異性化療藥物,其通過(guò)與細(xì)胞遺傳物質(zhì)相互作用以消滅腫瘤細(xì)胞,但由于具有骨髓抑制性和心臟毒性,不能用于老年患者或者心功能差的患者,因此臨床應(yīng)用受到一定的限制。FAN等[12]將人前列腺癌細(xì)胞異種種植于小鼠模型,然后將載DOX的靶向納米級(jí)超聲微泡造影劑引入小鼠,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲介導(dǎo)的載DOX納米粒破裂釋放的DOX能有效抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。載紫杉醇的靶向納米粒超聲造影劑能體外誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞凋亡,卵巢癌的盆腔種植性轉(zhuǎn)移可以使用腹腔內(nèi)注射載藥靶向納米粒超聲造影劑治療。載血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2) 靶向納米粒超聲造影劑可用于治療腦膠質(zhì)瘤,同時(shí)也用于開(kāi)放血腦屏障[14]。PERERA等[15]合成的脂質(zhì)殼多元納米粒能通過(guò)改變膜的流動(dòng)性和調(diào)節(jié)熱休克蛋白70的表達(dá),提高不同的腫瘤細(xì)胞株對(duì)化療和高熱反應(yīng)的敏感性,從而改善腫瘤射頻消融術(shù)效果。HU等[16]報(bào)道聲波穿透α v β 3的靶向納米粒超聲造影劑能暫時(shí)減慢血液流動(dòng),這有利于治療區(qū)域內(nèi)藥物的持續(xù)釋放,同時(shí)減少的血流量也可以使腫瘤縮?。?7]。
有研究[18]發(fā)現(xiàn),腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C (vascular endothelial growth factor C,VEGF-C) 緊密相關(guān),因此阻斷VEGF-C/VEGF-2信號(hào)傳導(dǎo)途徑是臨床抗腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的良策。葉鳴等[19]采用生物素-親和素連接法將載阿霉素微泡與抗人VEGFR-3 單克隆抗體相連,使其靶向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞后,可以阻斷VEGFR-3 表達(dá),抑制腫瘤誘導(dǎo)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,從而在一定程度上能夠抗腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。超聲波觸發(fā)納米粒破裂、釋放阿霉素瞬時(shí)提高靶組織藥物濃度,一定程度上能局部治療淋巴結(jié)內(nèi)的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞。
2.2.2 惡性腫瘤基因治療藥物的傳遞:在乳腺癌患者中,約五分之一左右的癌細(xì)胞表面有表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員HER2表達(dá),而乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與HER2基因的擴(kuò)增及其蛋白產(chǎn)物的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)[20-21]。SONG等[22]采用改良薄膜水化法制備了新型靶向HER2的納米粒超聲造影劑,并對(duì)其進(jìn)行了特異性細(xì)胞靶向能力和多模態(tài)成像檢測(cè),成像結(jié)果顯示此類納米粒比其他藥物傳遞方式具有更好的包封藥物能力,在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng),具有更好的腫瘤選擇能力、殺傷作用等優(yōu)點(diǎn)。YANG等[23]制備了針對(duì)HER2的腫瘤特異性雙模納米粒超聲造影劑,利用納米粒表面的抗腫瘤配體進(jìn)行腫瘤顯像。這一系列研究為乳腺癌患者尤其是HER2陽(yáng)性乳腺癌患者,提供了更有針對(duì)性的治療方案。近年來(lái),還有學(xué)者[24]使用非病毒性制劑 (包括注射DNA、脂質(zhì)體、多糖、脂多糖、納米顆粒、基因槍) 和靶向納米粒超聲介導(dǎo)的基因傳遞用于卵巢癌的基因治療,這大大改善了卵巢癌患者的預(yù)后。
2.2.3 靶向納米粒超聲造影劑用于腫瘤的早期診斷:新生血管的生成是腫瘤發(fā)生的重要標(biāo)志,腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移更依賴于新生血管的發(fā)展,因此根據(jù)腫瘤新生血管的分子變化實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷具有重要意義。目前多將VEGF-2、CD276和整合素α v β 3作為腫瘤血管靶向超聲造影劑的靶點(diǎn)。VEGF-2、CD276[25]和整合素α v β 3都是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的因子,這些因子在腫瘤新生血管內(nèi)皮表面呈特異性高水平表達(dá),而在對(duì)應(yīng)正常組織的血管內(nèi)皮上呈低表達(dá)甚至不表達(dá)[26]。BACHAWAL等[27]發(fā)現(xiàn)靶向VEGFR-2的納米粒能夠評(píng)估早期乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌的進(jìn)展,并能很好地區(qū)分良惡性實(shí)體腫瘤。卵巢癌的腫瘤相關(guān)血管生成與微血管α v β 3整合蛋白的表達(dá)增加有關(guān),BARUA等[28]發(fā)現(xiàn)使用靶向整合素α v β 3的納米粒能提高卵巢癌中新生微血管的檢出率,這為實(shí)現(xiàn)卵巢癌早期診斷的目標(biāo)提供了一種無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方法。
有文獻(xiàn)[29-30]表明,大部分卵巢癌細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)促黃體生成素釋放激素類似物 (luteinizing hormone releasing hormone,LHRHa) 受體,而在正常組織或細(xì)胞幾乎不表達(dá)。郭娟等[31]采用生物素-鏈霉親和素非共價(jià)結(jié)合方式制備靶向LHRHa的納米級(jí)超聲微泡造影劑,并用熒光標(biāo)記,以表面存在LHRH受體的卵巢癌細(xì)胞A2780/DDP為靶細(xì)胞,觀察其體外尋靶能力,這也為卵巢癌提供了一種新的診斷方式。
近年來(lái),還有研究者將液態(tài)氟碳的液氣相變特性和超聲反應(yīng)性材料的吸光特性結(jié)合,用激光照射成像部位,部分光能轉(zhuǎn)化為熱能導(dǎo)致液態(tài)氟碳液氣相變發(fā)生之后經(jīng)超聲探測(cè)器檢測(cè)到,從而實(shí)現(xiàn)靶組織顯像。夏瓊等[32]制備了包裹金納米棒-液態(tài)氟碳的雙模態(tài)納米級(jí)超聲微泡造影劑,體外顯像表現(xiàn)為超聲信號(hào)增強(qiáng),這表明光聲造影劑具有可行性,為以后的研究奠定基礎(chǔ)。目前研究較多的超聲反應(yīng)性材料是納米金棒;納米金棒是一種包裹金粒的納米級(jí)超聲微泡造影劑,其內(nèi)核可以載氟碳液體或其他藥物或基因,其超聲反應(yīng)性表現(xiàn)為在近紅外段808 nm左右有良好的吸收率[33],呈現(xiàn)高信號(hào),而人體在此段呈現(xiàn)低信號(hào)。
隨著分子影像學(xué)的發(fā)展,超聲造影劑能實(shí)現(xiàn)多功能成像和多模態(tài)顯像。多功能成像不僅能利用超聲造影劑進(jìn)行疾病的診斷,還能載藥物、基因等用于疾病的治療。目前國(guó)內(nèi)外研究較多的是多功能納米粒,這種多功能納米粒由多種顯像分子、靶向基因及藥物與特殊納米材料連接制備而成,以液態(tài)氟碳納米粒為代表。多模態(tài)顯像在進(jìn)行超聲分子成像的同時(shí)實(shí)現(xiàn)其他影像技術(shù)增強(qiáng)顯像,經(jīng)過(guò)后期處理將各種分子影像學(xué)的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合,使超聲分子影像學(xué)得到更好的發(fā)展。多模態(tài)靶向納米超聲造影劑已經(jīng)用于結(jié)合超聲增強(qiáng)造影成像和靶向治療,在診斷和治療各種疾病方面具有很大潛力,尤其是針對(duì)惡性腫瘤。
經(jīng)過(guò)多年的實(shí)驗(yàn),微米級(jí)超聲微泡造影劑 (如Sonovue) 已用于臨床,但納米粒超聲造影劑尚處于研究階段,仍存在很多問(wèn)題:(1) 靶向納米粒超聲造影劑制備技術(shù)還不是很成熟,目前大多數(shù)研究者使用液態(tài)氟碳作為造影劑的核心,其本身存在極低的生物毒性,對(duì)其生物安全性仍未知。 (2) 僅對(duì)靶向納米粒超聲造影劑的粒徑及電位比較了解,脂質(zhì)被膜是否光滑、到達(dá)靶點(diǎn)時(shí)是否仍完整包裹內(nèi)核等,一系列問(wèn)題還不清楚。 (3) 靶向納米粒超聲造影劑只進(jìn)入了腫瘤血管,實(shí)現(xiàn)了腫瘤血管內(nèi)顯像和治療,而不是腫瘤組織或細(xì)胞水平的診斷和治療。 (4)液態(tài)氟碳納米??山?jīng)過(guò)超聲波、激光和外加磁場(chǎng)產(chǎn)生相變,但是其作用機(jī)制還不清楚。 (5) 如何克服體內(nèi)高速血流的剪切力,增加微泡在高速血流下的黏附率,延長(zhǎng)微泡顯影時(shí)間,提高納米粒形態(tài)的穩(wěn)定性,仍是現(xiàn)階段存在的問(wèn)題。 (6) 靶向納米粒超聲造影劑尚未進(jìn)行臨床研究,僅在動(dòng)物身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn),兩者生理環(huán)境存在差異,不能有效說(shuō)明靶向納米粒超聲造影劑的功能特性。 (7) 靶向納米粒超聲造影劑作用效果取決于操作醫(yī)生的主觀意識(shí)和臨床經(jīng)驗(yàn)。隨著超聲分子影像學(xué)的發(fā)展,或許可以從分子層面完善靶向造影劑的穿透性和穩(wěn)定性等相關(guān)參數(shù)屬性,為臨床疾病的診治提供新方法。盡管對(duì)靶向納米粒超聲造影劑并不完全了解,但是國(guó)內(nèi)外專家進(jìn)行了一系列臨床前研究,這為靶向納米粒超聲造影劑用于臨床奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。