環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)在甘蔗轉(zhuǎn)基因及病害檢測中的應(yīng)用

王繼華 ，蔡時可 ，曹干 *

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣東 廣州510640；2.廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室，廣東 廣州510640）

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等2000年發(fā)明的一種新的恒溫核酸擴增方法，相較于傳統(tǒng)的核酸擴增方法，其具有靈敏度高、特異性強、操作簡單和快速高效及成本低等優(yōu)點，因此被廣泛應(yīng)用[1]。已經(jīng)報道多種轉(zhuǎn)基因（Genetically modified organism，GMO）動植物和病原可以利用LAMP檢測技術(shù)進行鑒定[1]。該技術(shù)也不斷進行完善和改進，應(yīng)用范圍和精度不斷提高，通過加入逆轉(zhuǎn)錄酶可以對RNA模板進行擴增（即RT-LAMP）[1]。近年來，轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展速度迅猛，2015年，28個國家的1800萬農(nóng)民種植了1.797億公頃的轉(zhuǎn)基因作物[2]。隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的增加，對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測要求也越來越嚴格，另一方面在轉(zhuǎn)基因作物的培育中對轉(zhuǎn)化植株的檢測量也不斷增加[3-4]，這些都需要大量的轉(zhuǎn)基因檢測工作，LAMP在這方面有著技術(shù)和成本上的優(yōu)勢，應(yīng)用成功的事件也越來越多。同時該技術(shù)還可以針對某一特異轉(zhuǎn)化事件的大豆、玉米進行檢測，并且也已經(jīng)建立標準[5-6]。近年來，LAMP也廣泛應(yīng)用在作物病害的檢測與檢疫，也建立多種甘蔗病害檢測體系。在病毒病的檢測方面，玉米褪綠斑駁病毒[7]和甘蔗花葉病毒[8]都已經(jīng)建立了檢測體系。本文就LAMP在甘蔗轉(zhuǎn)基因及病害檢測中的應(yīng)用進行綜述。

1 LAMP的基本原理與特點

1.1 LAMP的基本原理

LAMP技術(shù)的原理主要基于具有鏈置換活性的Bst（Bacillus stearothermophilus）DNA聚合酶和兩對特殊引物，使反應(yīng)中在模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，在等溫條件下使引物順利與模板結(jié)合并進行鏈置換擴增反應(yīng)。DNA聚合酶具有大片段的高效合成功能，具體的LAMP反應(yīng)過程主要包括啞鈴狀模板合成、循環(huán)擴增、伸長和再循環(huán)4步。其中，LAMP啞鈴狀模板合成是起始，由內(nèi)引物FIP的F2序列與模板DNA的F2c序列結(jié)合，形成互補的DNA鏈；外引物F3與模板DNA的F3c序列配對，形成互補鏈。再通過置換反應(yīng)，F(xiàn)IP引導(dǎo)合成的互補鏈被釋放，由于在其末端的F1c和F1可以進行配對，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。引物BIP和B3可以結(jié)合到環(huán)的上引導(dǎo)合成，置換出BIP指導(dǎo)合成的雙鏈。BIP指導(dǎo)合成出來的互補鏈在被置換后的兩端可以自動成環(huán)（啞鈴）結(jié)構(gòu)。啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA是LAMP反應(yīng)新模板，在此基礎(chǔ)上進行隨后的循環(huán)擴增反應(yīng)，最終獲得分子量大小不一的擴增產(chǎn)物[1，9]。在此基礎(chǔ)上通過設(shè)計一條特異的loop引物可以在LAMP反應(yīng)中形成環(huán)的部位進行引導(dǎo)，提高合成速度50%以上[10]。

在一般情況下，LAMP可以在60 min內(nèi)對目標片段擴增出109～1010倍的序列拷貝，產(chǎn)物的濃度高達500 μg/mL的DNA，其擴增產(chǎn)物既可通過常規(guī)的熒光定量或電泳檢測，也可以通過簡易的目測比色和焦磷酸鎂濁度檢測[1，11]。若在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，LAMP還可以實現(xiàn)對RNA模板的擴增（即RT-LAMP）[12-13]，目前也有一些方法進行了改進[14]。同時，也開展了多基因的多重擴增，在動植物病害檢測上已成功應(yīng)用[15-16]。

1.2 LAMP的特點

1.2.1 反應(yīng)速度快，靈敏度高 LAMP依賴高活性的Bst DNA聚合酶，具有快速、高效的特點。該DNA聚合酶不需要像常規(guī)PCR反應(yīng)，每一個循環(huán)中都需要變性過程，反應(yīng)在55～65℃的溫度范圍內(nèi)均可進行大量擴增，通過不斷的優(yōu)化和改進，整個反應(yīng)的時間可以控制在30 min以內(nèi)[17-18]。LAMP反應(yīng)中，在DNA聚合酶的作用下，擴增產(chǎn)物呈幾何數(shù)量級增加，在60 min內(nèi)可以獲得109倍的目標產(chǎn)物，比常規(guī)PCR技術(shù)和巢式PCR技術(shù)要高出 1～3 個數(shù)量級[1，9，19]。

1.2.2 特異性高，穩(wěn)定性好 LAMP采用對目的片段的6個不同部位進行引物設(shè)計，在反應(yīng)過程中需要4對引物來共同完成擴增，這就需要4對引物能夠完全和目標片段進行匹配才能進行擴增，通過對嚴格靶序列上的這些獨立區(qū)域進行嚴格選擇就能控制反應(yīng)的特異性。和常規(guī)PCR相比，其通過引物的選擇就提高了反應(yīng)的特異性和穩(wěn)定性[20]。

1.2.3 成本低，技術(shù)要求低 完成LAMP檢測所需要的設(shè)備簡單。由于反應(yīng)在恒溫中進行，水浴鍋或其它普通可控溫的普通恒溫設(shè)備均可以，和其它PCR相比較，不需要專門的儀器來完成反應(yīng)。在結(jié)果判讀方面，其擴增產(chǎn)物可以直接通過肉眼來進行可視化的判讀，通過觀察擴增管的濁度即可，不需要進行瓊脂糖凝膠電泳。并且，擴增目的片段的產(chǎn)量與濁度成正比，完全可以通過濁度直接進行擴增量的判斷[1，11]。同時，在反應(yīng)中添加熒光染料（SYBR Green I[1]和HNB[21-22]）參與合成反應(yīng)，結(jié)果直接通過觀察顏色的變化來判斷，結(jié)果更容易觀察，更準確。

2 LAMP技術(shù)在甘蔗轉(zhuǎn)基因及病害檢測中的應(yīng)用

2.1 LAMP技術(shù)在甘蔗轉(zhuǎn)基因及病害檢測中的應(yīng)用策略

已經(jīng)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物都是經(jīng)過嚴格的生物安全性評價，沒有食品安全的風險[23]。但是，由于在法律上管理嚴格，GMO的檢測在生產(chǎn)上尤為重要。目前商業(yè)化種植的作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜籽及木瓜等，外源功能基因主要有抗除草劑、抗蟲、抗病等功能基因?？瓜x類：主要是Bt基因；抗除草劑基因：EPSPES、BAR和PAT等，以及抗木瓜環(huán)斑病的CP基因[24]。在GMO的檢測中，即可對目標基因進行特異性檢測，同時也可以對轉(zhuǎn)化過程中的一些轉(zhuǎn)基因相關(guān)的元件進行通用的檢測，GMO研制過程中的一些主要的特異元件包括：啟動子、終止子以及抗性標記基因。常見的啟動子元件如35S啟動子[25-26]、UBI啟動子和ACT啟動子等；終止子如NOS終止子；標記基因如：NPT和HYG[27]。同樣，針對甘蔗病原基因組的高度同源性區(qū)域也可以設(shè)計相應(yīng)的檢測體系，如花葉病毒的外殼蛋白基因。LAMP檢測在GMO的應(yīng)用上非常廣泛，不僅可以通過這些已知的特異片段設(shè)計通用引物進行鑒定[28]，而且，通過對商業(yè)化種植的作物中外源基因的插入位點進行分析，確定插入位點上下游的基因，再利用目的基因和上下游基因的序列設(shè)計特異引物，可以構(gòu)建該轉(zhuǎn)化事件特異性的檢測[29]。

2.2 LAMP技術(shù)在甘蔗轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物遺傳改良中的應(yīng)用也越來越廣泛，獲得的轉(zhuǎn)基因植物也越來越多，目前報道的轉(zhuǎn)基因植物累計超過35科120多種[2]。利用LAMP技術(shù)進行轉(zhuǎn)基因作物檢測的實例較多，目前已應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、木瓜和油菜[26，29-39]。在轉(zhuǎn)基因育種中，轉(zhuǎn)化子的檢測需要較大的工作量，特別是在分離群體中鑒定出純合子，以及在雜交后代中篩選含有目標基因的植株，這些都需要大量的PCR檢測來確定；LAMP的成本低，技術(shù)要求簡單，快速的特點能夠滿足這些檢測的需要。同時，在構(gòu)建指紋圖譜，保護知識產(chǎn)權(quán)方面，LAMP技術(shù)可以對擬商業(yè)化品種設(shè)計特異的檢測標準。甘蔗是重要的糖料作物，遺傳背景復(fù)雜，雜交育種效率低，轉(zhuǎn)基因育種在甘蔗上有著較好的應(yīng)用前景[40]。在甘蔗轉(zhuǎn)基因育種中LAMP檢測已經(jīng)得到應(yīng)用。周定港等利用LAMP檢測轉(zhuǎn)Bt基因甘蔗，檢測效率達到100%，高于常規(guī)PCR的檢測[41]。

2.3 LAMP在甘蔗病害檢測中的應(yīng)用

甘蔗生長在高溫高濕地區(qū)，加之生長周期長，在生產(chǎn)上病害較多，包括真菌病害、細菌病害和病毒病。病原菌的檢測技術(shù)在甘蔗抗病育種和病害防治中有重要作用。目前甘蔗病害的分子檢測還相對薄弱，大多以常規(guī)PCR來進行鑒定。LAMP在檢測技術(shù)和其它檢測方式相比，有其自身的優(yōu)點，已經(jīng)在植物病害檢疫和研究中得到應(yīng)用，如玉米褪綠斑駁病毒[7]和甘蔗花葉病毒[8，42]。在甘蔗生產(chǎn)上，病原的準確檢測可為有效防治提供技術(shù)支持，特別是在不易培養(yǎng)和種傳的病害檢測上。甘蔗花葉病和宿根矮化病在發(fā)病早期很難通過肉眼直觀診斷病害，在生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)較晚，往往帶來嚴重損失。目前利用LAMP檢測這兩種病原最為常見[42-45]，在甘蔗其它病害方面，如黑穗病[46-47]、甘蔗赤腐病[48]和甘蔗黃銹病[49]的LAMP檢測技術(shù)也已經(jīng)成功。LAMP檢測技術(shù)在甘蔗病害檢測方面的發(fā)展趨勢是操作簡單化，主要是結(jié)果判斷的可視化。通過田間Keizerweerd利用反轉(zhuǎn)錄LAMP可同時檢測甘蔗花葉病毒和高粱花葉病毒[42]。

2.4 LAMP技術(shù)檢測的標準化

GMO至誕生以來，擔憂其生物安全性的質(zhì)疑就沒有停止。嚴格的生物安全性管理為甘蔗轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化應(yīng)用提供有利的保障。轉(zhuǎn)基因的分子檢測是重要的證據(jù)，LAMP技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物檢測的各個環(huán)節(jié)，其特異檢測標準在轉(zhuǎn)基因大豆和玉米已經(jīng)建立[16-17]，但是在轉(zhuǎn)基因甘蔗上還沒有固定的標準。LAMP檢測的標準化主要應(yīng)集中在共性檢測，如針對插入元件的檢測，啟動子等元件。也可以針對某一商業(yè)化的甘蔗轉(zhuǎn)基因品種進行，建立起指紋擴增區(qū)域，用于知識產(chǎn)權(quán)的保護。在甘蔗病害的檢測上，建立標準化的LAMP檢測體系有利于檢驗結(jié)果的可靠性和權(quán)威性。通過對多種甘蔗病害基因進行整合，開發(fā)多重病原的LAMP檢測試劑盒，簡化操作步驟，增加結(jié)果的可視性，不依賴實驗室操作，在田間現(xiàn)場即可以使用。

3 展望

LAMP技術(shù)的建立與發(fā)展為GMO的檢測提供了簡便快速的方法，特別是在對GMO監(jiān)管嚴格的要求下，該技術(shù)憑借其自身的優(yōu)點在甘蔗上的應(yīng)用將越來越多，為今后轉(zhuǎn)基因甘蔗的商業(yè)化應(yīng)用提供一定的技術(shù)支撐，具有良好的市場前景。在商業(yè)化的檢測中，開發(fā)設(shè)計通用引物，提高檢測的范圍，最終為建立甘蔗轉(zhuǎn)基因和甘蔗病害檢測的統(tǒng)一標準體系，獲得法律認證，開發(fā)相應(yīng)的試劑盒打下基礎(chǔ)，這也將是該技術(shù)在甘蔗轉(zhuǎn)基因及病害檢測應(yīng)用中的發(fā)展方向。