甜櫻桃病毒病及苗木脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

付全娟，魏國芹，侯森，楊興華，孫玉剛

(山東省果樹研究所，山東泰安 271000)

甜櫻桃(PrunusaviumL．)為薔薇科李屬櫻亞屬植物，原產(chǎn)于歐洲，引入中國栽培已有一百多年，是目前栽培效益最高的果樹之一。甜櫻桃果實外觀鮮艷、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富，素有“春果第一枝”的美譽(yù)。中國自19世紀(jì)70年代開始引種栽培甜櫻桃，目前栽培面積達(dá)到14萬hm2，產(chǎn)量約50萬t[1]。但是，隨著櫻桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，病毒病逐漸成為影響甜櫻桃產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素[2,3]。

Nemeth(1986)認(rèn)為櫻屬病毒主要有 68 種，其中可以侵染甜櫻桃的病毒約有 34 種，常見的主要有20種[4]，其中11種已在中國相繼發(fā)現(xiàn)并報道[5]。Pallas(2012)研究表明，甜櫻桃病毒病發(fā)生率為45.6%，其中76.4%為多種病毒混合侵染導(dǎo)致[6]。甜櫻桃病毒病主要引起樹體衰弱、葉片卷曲、花葉或環(huán)斑、果實畸形或小果或病害如流膠、根癌病易發(fā)生，甚至樹體死亡。當(dāng)今世界各主產(chǎn)國對甜櫻桃病毒病主要通過培育脫毒苗進(jìn)行防治，因此苗木的病毒脫除技術(shù)是脫毒苗培育的關(guān)鍵。目前苗木的脫毒技術(shù)可分為熱處理法、微莖尖法、化學(xué)藥劑法和基因工程技術(shù)4大類[7]。筆者對國內(nèi)常見的幾種病毒病和常用脫毒技

術(shù)進(jìn)行綜述，為甜櫻桃無毒栽培及無病毒苗木的培育提供理論和技術(shù)支持。

1 甜櫻桃常見病毒病

1.1 李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)

PNRSV是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)家族中的一種球形植物病原病毒，也是分布最廣、危害最嚴(yán)重的李屬病毒。Pimentel(2007)認(rèn)為甜櫻桃樹感染該病毒后，容易并發(fā)櫻桃卷葉病毒(CLRV)，導(dǎo)致產(chǎn)量快速下降[8]。感染該病毒易引起櫻桃壞死環(huán)斑病和皺縮花葉病，癥狀有壞死環(huán)斑、線紋、帶狀葉、粗花葉，有時還會產(chǎn)生耳突，病葉呈破碎狀，出現(xiàn)壞死斑、穿孔、脫落，嚴(yán)重的甚至全株枯死。該病毒主要通過機(jī)械、種子、花粉、線蟲等多種途徑傳播，也可以通過受侵染的植物繁殖材料的調(diào)運進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。因此各國對PNRSV的檢疫十分重視，1992年中國將其列為入境檢疫危險性有害生物[9]。

1.2 李矮縮病毒(PDV)

PDV是雀麥花葉病毒科等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬成員之一，病毒粒子呈球形，可引起櫻桃黃化花葉病、櫻

桃褪綠環(huán)斑病，與PNRSV侵染植物的癥狀相似，造成樹體發(fā)育不良、葉片畸形、褪綠環(huán)斑、壞死斑和黃化花葉等癥狀。PDV與PNRSV兩種病毒常伴隨侵染。單獨性或和其他病毒復(fù)合性的侵染會影響果實的產(chǎn)量和樹木的生長。主要通過嫁接、種子、花粉傳播。PDV在全世界普遍發(fā)生，為中國入境檢疫危險性有害生物[11]。

1.3 櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(CGRMV)

CGRMV屬于乙型線性病毒科(Betaflexiviridae)，病毒粒子呈彎曲的線條形，長 1000～2000nm。其寄主范圍廣，可侵染甜櫻桃、酸櫻桃、觀賞櫻桃、桃、杏等多種李屬植物，廣泛分布于非洲、亞洲(主要是中國和日本)、南美洲、新西蘭等地。CGRMV感染甜櫻桃后無明顯癥狀，是一種典型的潛隱性病毒，感染酸櫻桃后，葉片出現(xiàn)黃色或綠色斑駁，果實畸形，味苦，經(jīng)濟(jì)效益低[4]。

1.4 櫻桃小果病毒(LChV)

引起櫻桃小果病的幾個分離物L(fēng)ChV-1、LChV-2、LChV-3均為長線形病毒科(Clostero -viridae)葡萄病毒屬(Ampelovirus)。通過汁液、嫁接和昆蟲介體傳播，1986年在加拿大發(fā)現(xiàn)新的傳播介體為蘋果粉蚧(Phenacoccusaceris)，侵染櫻桃后傳播迅速。LChV引起櫻桃小果病，其癥狀多樣。葉片邊緣有輕微卷曲，帶有紅黃色的碎邊；果實癥狀通常發(fā)生在果實生長初期，收獲時感病果實只有正常果實的1/3～1/2大小，果實呈暗紅色，畸形，味淡，即使沒有出現(xiàn)上述癥狀，果實也會成熟過晚[7]。

1.5 櫻桃病毒A(CVA)

CVA 屬于乙型線性病毒科(Betaflexiviridae)毛狀病毒屬(Capillovirus)，可侵染桃、李、杏和櫻桃等李屬植物，通過嫁接傳播。單獨感染后寄主無明顯癥狀，是一種典型的潛隱性病毒，一旦與其他病毒復(fù)合侵染，會引起嚴(yán)重病害，該病毒可能是病毒病發(fā)生的增效劑，加速病害發(fā)生[12]。

1.6 櫻桃卷葉病毒(CLRV)

CLRV為豇豆花葉病毒科(Comoviridae)線蟲多面體病毒屬(Nepovirus)C亞組成員?？梢酝ㄟ^劍線蟲、種子、花粉、嫁接傳播，也可以通過機(jī)械摩擦傳播。CLRV引起櫻桃卷葉病，植株表現(xiàn)為葉芽伸長和開花延遲且生長脆弱，葉邊向上卷起，類似枯萎，部分葉片在生長時期會變成紫紅色或產(chǎn)生淺綠色的環(huán)斑。在同 PNRSV或PDV造成的復(fù)合侵染時，能夠引起櫻桃樹勢的迅速下降，葉變小，出現(xiàn)脈明、流膠現(xiàn)象，被侵染的樹會在5年內(nèi)死亡[13]。

2 常用脫毒技術(shù)

目前甜櫻桃常用苗木脫毒技術(shù)可分為熱處理法、微莖尖法、化學(xué)藥劑法和基因工程技術(shù)4大類。

2.1 熱處理法

熱處理法的原理是根據(jù)感染病毒和寄主植物對高溫忍耐程度的差異，在一定的溫度下(37～40℃)，病毒被鈍化，失去增殖和再感染能力，從而使寄主細(xì)胞的生長速度超過病毒擴(kuò)散速度，即在生長點附近得到小部分不含有病毒的分生組織，切下這部分進(jìn)行人工培養(yǎng)或嫁接到無病毒砧木上得到無病毒的苗木[7]。熱處理的效果與病毒的致死溫度沒有相關(guān)性，但與病毒顆粒的形狀有關(guān)，線狀和球狀病毒在一定高溫下易被鈍化，而對桿狀病毒效果較差[4]。選擇適當(dāng)?shù)臏囟群吞幚頃r間是脫毒成功的關(guān)鍵。近年來研究表明，用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的方法培育無病毒母本苗效果較好，特別是對于一些用單純的莖尖培養(yǎng)或熱處理難以脫除的病毒，采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)方法可明顯提高脫毒效率[14]。

2.2 微莖尖法

病毒在植物體內(nèi)的不同組織和部位分布不均勻，病毒粒子隨著植物組織成熟而增加，旺盛生長的莖尖和根尖一般無病毒或很少，不含有病毒的部分不超過 0.1～0.5mm[15]。

2.2.1 莖尖組織培養(yǎng) 切取櫻桃0.1～0.3mm 分生組織培養(yǎng)，能有效消除ACLSV、PDV、CGRMV、LChV、線蟲傳多角體病毒組病毒(Nepoviruses)、歐洲銹斑駁病毒等多種病毒，并且可以發(fā)育出完整的植株[16]。莖尖培養(yǎng)的最大缺點是不易培養(yǎng)，生根和移栽成活率低。另外，莖尖分化率與莖尖大小成正比，脫毒率與莖尖大小成反比，因此脫病毒時要兼顧脫毒率和成活率兩個方面。一般切取長度為 0.2～0.5mm帶有1～2 個葉原基的莖尖，既可保證一定的成活率，又能使一定數(shù)量的莖尖苗不帶病毒[4]。伍克俊等[17]在甜櫻桃脫毒時，利用熱處理結(jié)合小莖尖分生組織培養(yǎng)比單獨使用小莖尖培養(yǎng)脫毒率高，脫毒率達(dá)80%。

熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法可以達(dá)到同時脫除幾種病毒的目的，且經(jīng)熱處理長出綠枝可切取較大的莖尖接種培養(yǎng)，既操作方便，易于分化出苗，又降低了變異率，故生產(chǎn)中應(yīng)用的較多。

2.2.2 微莖尖嫁接法 微莖尖嫁接是Marashige等提出，將組織培養(yǎng)與嫁接方法相結(jié)合，用以獲得無病毒苗木的一種新技術(shù)。一般認(rèn)為大多數(shù)植物的種子是不帶毒的，采集砧木種子，表面消毒后播于事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中培養(yǎng)成苗。2周后，在無菌條件下切下頂部，留下長1～1.5cm的上胚軸部分，取優(yōu)良品種莖尖1mm，倒丁字水平嫁接在砧木上培養(yǎng)即可。這種技術(shù)首先成功應(yīng)用于柑桔脫病毒，以后逐漸應(yīng)用到其它多種果樹病毒的脫除。Degratias等[18]利用微體嫁接技術(shù)脫除了櫻桃和桃的褪綠葉斑病毒；馬鳳桐等[19]用微體嫁接技術(shù)得到了柑桔屬脫毒苗。微體嫁接除了可培育無病毒植株外，還可解決生根難的問題。目前，微體嫁接成功地獲得脫毒苗木的植物有杏、釀酒葡萄、桉樹、山茶、桃、李、櫻桃、蘋果和柑桔等[20]。

2.3 化學(xué)藥劑脫毒法

某些核酸代謝的拮抗物和抗生素類物質(zhì)能抑制核苷酸或核酸的生物合成，因此被用來抑制植物病毒。目前國際上常用化學(xué)藥劑是病毒唑(Ribavirin)和 DHT。病毒唑的三磷酸具有活性，可抑制病毒RNA形成帽子結(jié)構(gòu)，而DHT(2，4-二氧六氫-1，3，5-三嗪)既可破壞RNA聚合酶的合成，又可破壞病毒外殼蛋白的合成，從而抑制病毒的繁殖。

化學(xué)藥劑脫毒法常與組織培養(yǎng)結(jié)合進(jìn)行，Deogruties等[21]在培養(yǎng)基中添加病毒唑，成功脫除甜櫻桃ACLSV、PNRSV、PDV等病毒。Cieslinska[22]采用熱處理結(jié)合病毒唑方法對感染PDV病毒的甜櫻桃進(jìn)行脫毒處理，脫毒率達(dá)到93%。此脫毒法可獲得較大的莖尖用于組織培養(yǎng)，但病毒抑制劑易導(dǎo)致后代變異?；瘜W(xué)藥劑脫毒法的應(yīng)用效果，因病毒種類而不同，不能脫除所有病毒，但方便快捷，操作簡單，故對抗病毒藥品的研究和開發(fā)具有廣闊的前景。

2.4 基因工程技術(shù)

利用基因工程技術(shù)培育抗病毒的品種是目前防治病毒病的最有效和最根本的辦法。研究顯示，有效的抗病毒基因主要來源于病毒本身，如外殼蛋白基因、RNA干擾、運動蛋白基因、衛(wèi)星 RNA、復(fù)制酶基因等。

2.4.1 外殼蛋白基因 Bachy首次將煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白基因成功地導(dǎo)入煙草，培育出了能穩(wěn)定遺傳的抗病毒煙草植株；劉輝[23]將蘋果莖溝病毒的外殼基因成功導(dǎo)入煙草。研究表明，外殼蛋白基因介導(dǎo)的抗性是由于外殼蛋白的積累干擾了病毒的脫殼，同時抑制了病毒在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運和復(fù)制。這是抗病毒植物基因工程上采用最普遍的一種，目前已有30多種植物病毒獲得成功。

2.4.2 RNA干擾技術(shù) Orbegozo等[24]將馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)的部分基因片段，構(gòu)建RNAi載體，獲得馬鈴薯抗性轉(zhuǎn)基因株系。Liu等[25]利用RNAi技術(shù)獲得核果類病毒PPV、PDV、PNRSV、ToRSV、APLPV、PMV的抗性煙草植株。Song等[26]發(fā)現(xiàn)櫻桃砧木Gisela 6和Gisela 7轉(zhuǎn)化PNRSV基因干擾載體后可抗PNRSV和PDV的復(fù)合侵染。

2.4.3 運動蛋白基因 運動蛋白基因介入是阻斷病毒產(chǎn)物表達(dá)，限制病毒在植物細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運，從而達(dá)到抗病毒的目的。Martinelli[27]等成功將葡萄病毒 A和B的運動蛋白基因轉(zhuǎn)移到煙草中，獲得具有不同程度的抗病毒轉(zhuǎn)基因煙草植株。隨后，又將這2種病毒的運動蛋白基因介入葡萄植株，獲得具有抗性的再生植株。

為進(jìn)一步提高工程植株的抗病性，目前人們多采用復(fù)合基因策略，即轉(zhuǎn)多種抗性基因控制一種病毒，可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性強(qiáng)度和抗病的持久性和廣譜性，這是轉(zhuǎn)基因抗病毒育種產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的趨勢。

3 存在的問題與展望

目前，國際上已有34種櫻桃病毒病被相繼報道，中國有報道的侵染甜櫻桃的病毒有11種，中國對甜櫻桃病毒病病原的研究還不全面。有必要結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如基因雜交、RNA電泳、酶聯(lián)免疫法、免疫捕捉PCR技術(shù)、實時熒光PCR技術(shù)等，建立快速有效的檢測方法，加強(qiáng)病毒檢疫檢驗。

國內(nèi)外對于甜櫻桃病毒病尚無有效的治療措施，主要通過培育脫毒苗進(jìn)行防治。但是脫毒效果受多種因素的影響，如材料的基因型、生長狀態(tài)、病毒種類、處理條件、操作技術(shù)等，所以在選擇脫毒方法時，可以用單一的脫毒方法，也可以將幾種方法結(jié)合使用。另外，抗病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)是從作物自身出發(fā)，通過基因工程手段轉(zhuǎn)入外源抗病毒基因，并在作物體內(nèi)表達(dá)達(dá)到直接抗病毒的目的，將是今后果樹無病毒技術(shù)研究的熱點。