p53／PUMA通路與器官纖維化的研究進展

王 偉，于力克，徐春華，張映銘

（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京市胸科醫(yī)院：1內(nèi)鏡中心，2肺灌洗中心，江蘇 南京210009；3南京市呼吸和影像臨床醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京 210009）

0 引言

p53作為抑癌基因，具有“基因守護者”之名，在調(diào)節(jié)細胞周期、促凋亡、及阻遏惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用［1-3］。p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）是 p53下游靶基因，最早被 Nakano 等［4］定位于 19q1 3.3～1 3.4。PUMA 基因具有四種亞型（α，β，γ，δ），其中 γ，δ 缺少BH3結(jié)構(gòu)域，無法誘導(dǎo)細胞凋亡。PUMA蛋白屬于Bcl-2亞家族，在人和大鼠基因組中具有高度保真性；但當(dāng)生物體處于應(yīng)激狀態(tài)時，PUMA可被激活上調(diào)，促進細胞凋亡。與以往發(fā)現(xiàn)的其他p53靶基因比較，PUMA的促凋亡功能具有兩方面重要特征：①PUMA經(jīng)內(nèi)、外源性p53誘導(dǎo)激活后再與p53二者聯(lián)合，表現(xiàn)出強大的促凋亡功能，且PUMA幾乎介導(dǎo)p53依賴的所有凋亡信號，因此被認(rèn)為是p53誘導(dǎo)細胞凋亡信號途徑的最關(guān)鍵成員［5］。②PUMA的活化方式復(fù)雜多樣，不僅可以介導(dǎo)p53依賴／p53非依賴的凋亡信號，也可通過胞內(nèi)核漿信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等反饋性影響，與Bcl凋亡家族基因起到相互調(diào)控作用［6］。一直以來，有關(guān)p53／PUMA通路的研究多側(cè)重于惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面［7-10］，然而隨著細胞發(fā)源和分子機制研究的深入，p53／PUMA在器官損傷修復(fù)和纖維化中的作用也逐漸為人所認(rèn)識，本文擬對近年來p53／PUMA信號通路與纖維化疾患的研究按不同器官作相關(guān)綜述。

1 p53和／或PUMA與器官纖維化

1.1 p53和／或與腎纖維化 糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是1型糖尿病患者首位死因和2型糖尿病的最常見并發(fā)癥之一，又稱糖尿病性腎小球硬化癥，其中腎纖維化是病變的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。Deshpande等［11］檢測 DN小鼠腎皮質(zhì)細胞的 p53、TGF-β與腎小球纖維化程度相關(guān)；進一步研究發(fā)現(xiàn)DN小鼠模型中存在TGF-β誘導(dǎo)的p53-miRNA-192反饋環(huán)路，TGF-β激活可促進該環(huán)路效應(yīng)放大，加劇纖維化。Samarakoon等［12］對梗阻性腎病繼發(fā)腎纖維化的研究做了薈萃分析，結(jié)果提示，p53與TGF-β1／Smad有協(xié)同作用，p53表達上升加重了梗阻性腎病的纖維化程度。這些研究提示p53信號通路參與促進腎纖維化的發(fā)生，其發(fā)生機制中存在microRNA的表觀修飾調(diào)控。

1.2 p53和／或PUMA與肝纖維化 肝纖維化是對各種因素引起慢性肝臟損傷的一種代償性反應(yīng)，輕度者可逆轉(zhuǎn)，如刺激因素持續(xù)也易于繼發(fā)肝硬化，非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）即是其一，肝細胞脂性凋亡是預(yù)示肝纖化發(fā)生的重要標(biāo)志。Daugherity等［13］發(fā)現(xiàn)該病模型小鼠肝細胞的氧化應(yīng)激和脂性凋亡明顯增加，導(dǎo)致PUMA和共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變蛋白（ataxia telangiectasia mutated，ATM，屬于DNA損傷關(guān)卡蛋白）活化，表達上升，促進了肝纖維化發(fā)生；而敲除ATM基因的NAFLD小鼠的PUMA表達水平明顯下降，肝纖維化病理改變亦相應(yīng)緩解。亦有研究［14］發(fā)現(xiàn)，向經(jīng)四氯化碳暴露處理的小鼠予以慢性酒精刺激，構(gòu)建肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)小鼠肝細胞特異性缺氧誘導(dǎo)因子（hepatocyte-specific hypoxia-inducible factor 1α， HIF1α）過表達，誘導(dǎo)p53k386水平升高，PUMA蛋白表達增加，促進了肝細胞凋亡失衡和肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。肝星狀細胞（hepatic stellate cell，Hsc）是肝臟分泌細胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，EcM）的主要細胞，其激活和增殖是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如何控制Hsc的激活，逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程，是抗肝纖化研究的熱點之一。新近研究［15］發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷可能通過內(nèi)在線粒體依賴的信號通路調(diào)控人和小鼠肝星狀細胞株T6（hepatic stellate cell line-T6，HSC-T6）的 PUMA 上調(diào)和抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)，促進Hsc凋亡，從而控制肝纖化進展。

1.3 p53和／或PUMA與皮膚及附屬器的纖維化皮膚及附屬器是最易發(fā)生損傷修復(fù)的器官組織，主要是因為皮膚成纖維細胞（skin fibroblasts，SF）的活化增殖與瘢痕形成、皮膚硬化關(guān)系密切。研究［16］表明，皮膚成纖維細胞p53／PUMA在皮膚損傷后修復(fù)過程中有過表達現(xiàn)象，可能參與皮膚纖維硬化和瘢痕形成。也有研究［17］表明，喜嚼檳榔者易于誘發(fā)口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis，OSF），取材其口腔黏膜細胞，發(fā)現(xiàn)p53呈現(xiàn)過表達。滑膜增生是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）關(guān)節(jié)硬化的主要病理改變，其程度與RA患者關(guān)節(jié)功能和預(yù)后密切相關(guān)。Cha等［18］發(fā)現(xiàn)，Slug蛋白是Snail鋅指轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，是E-鈣黏蛋白（E-cadherin）啟動子的抑制子，研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H2O2氧化應(yīng)激誘導(dǎo)后，RA患者滑膜組織中成纖維細胞樣滑膜細胞（fibroblastlike synoviocytes，F(xiàn)LS）的 Slug明顯升高，而經(jīng) Slug siRNA處理的FLS中PUMA表達亦升高，該過程不受p53調(diào)控。這一實驗驗證了PUMA可不依賴p53發(fā)揮促凋亡作用，并表明PUMA與Slug存在調(diào)控關(guān)系，后者可能成為未來治療RA的潛在靶點。

1.4 p53 和／或 PUMA 與心肌纖維化 有實驗［19］表明，p53／PUMA-／-小鼠的心臟血管在超壓力負(fù)荷刺激狀態(tài)下出現(xiàn)了血管壁纖維化，而p53／PUMA+／+小鼠未出現(xiàn)類似效應(yīng)，提示p53／PUMA的表達異常參與調(diào)控心臟血管纖維化進程。多柔比星誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠模型中，p53蛋白異常表達與心肌纖維化具有相關(guān)性［20］。心衰小鼠模型試驗也觀察到，心肌血管內(nèi)皮細胞p53基因缺失，可減輕血管壓力負(fù)荷，阻遏心肌從肥大向纖維化衰竭的惡化，而p53基因表達上調(diào)則導(dǎo)致心肌血管稀疏和心肌纖維化［21］。應(yīng)用凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分離的缺血-再灌注模型小鼠的心肌細胞，可促進其凋亡，然而，進一步下調(diào)胞內(nèi)PUMA基因表達則可阻止心肌細胞凋亡，表明雖有外界誘導(dǎo)凋亡的刺激，但真正執(zhí)行凋亡程序仍需PUMA參與；進一步條件敲除小鼠PUMA基因，并建立主動脈弓縮窄模型，發(fā)現(xiàn)PUMA-／-鼠心肌細胞的凋亡和纖維化得以減緩；且該作用不完全依賴p53的激活。更進一步，在慢性擴心病致心衰鼠模型上重復(fù)試驗，未見類似心肌細胞表型改變。故推論：PUMA是細胞應(yīng)激下心室重構(gòu)和心力衰竭過程信號通路的關(guān)鍵組成部分，可望成為未來治療應(yīng)激性心衰的靶點［22］。

1.5 p53和／或PUMA與肺纖維化 肺纖維化一直是困擾臨床的難題［23］，目前尚無特效治療方法。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，炎癥是導(dǎo)致IPF損傷和纖維化的主要原因，后發(fā)現(xiàn)臨床抗炎治療收效甚微。新近研究理念認(rèn)為：肺成纖維細胞（pulmonary fibroblasts，PF）增殖與纖維形成可獨立于炎癥發(fā)生，PF活化和凋亡失衡是肺纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，細胞凋亡及相關(guān)信號通路作用現(xiàn)已成為肺間質(zhì)疾病的研究熱點之一［24］。有研究［25］通過活性氧產(chǎn)物對原代培養(yǎng)的IPF小鼠肺成纖維細胞造成氧化應(yīng)激壓力，發(fā)現(xiàn)鼠PF出現(xiàn)異?；罨鲋常a(chǎn)生肺纖維化病理改變，并發(fā)現(xiàn)在此過程中p53的早期磷酸化和不同表達水平的PUMA蛋白通過內(nèi)、外凋亡途徑誘導(dǎo)了PF凋亡失衡，進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，加入ATM的激酶抑制劑，上述效應(yīng)可減弱緩解。該實驗表明，ATM是p53／PUMA在是誘導(dǎo)PF異常凋亡的一個關(guān)鍵激活信號，有望作為IPF潛在的治療靶點。同樣，肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡是IPF病情進展的重要標(biāo)志。Bhandary等［26］制作IPF小鼠模型，發(fā)現(xiàn)博來霉素誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細胞中p53表達明顯上升，且p53基因中有與尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator， uPA）和纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）的結(jié)合序列，在出現(xiàn)肺纖維化時這種結(jié)合效應(yīng)增強，實驗提示，抑制p53-uPA、PAI-1表達可能作為一種新的干預(yù)策略，來防治急性肺損傷和肺纖維化。

上述試驗從細胞-動物水平證實p53和／或PUMA在肺纖維化進程中發(fā)揮重要作用。Oshikawa等［27］從臨床角度出發(fā)，檢測了IPF、肺癌、肺氣腫患者和健康志愿者的血清中抗p53抗體，發(fā)現(xiàn)IPF組患者p53抗體水平明顯升高，認(rèn)為其表達與肺纖維化有正相關(guān)性，但未具體研究p53通路在IPF中的具體調(diào)控基因。Bridges等［28］分析了17例IPF患者病變肺組織基因表達譜，發(fā)現(xiàn)p53／PUMA通路可能通過調(diào)控凋亡抑制蛋白Twist1來誘導(dǎo)肺成纖維細胞增殖，促進肺纖維化發(fā)展，二者實驗初步表明p53和PUMA很可能參與調(diào)控IPF患者的臨床疾病演變。作者所在課題組前期實驗也發(fā)現(xiàn)，矽肺患者血清p53／PUMA表達高于健康對照組，以SiO2誘導(dǎo)人肺成纖維細胞后，胞內(nèi)p53、PUMA表達均上調(diào)，并參與調(diào)控成纖維細胞活化、增殖和遷移，導(dǎo)致膠原沉積進而出現(xiàn)肺纖維化［29］，為 p53／PUMA 通路調(diào)控肺纖維化進程提供了一定的臨床和實驗依據(jù)，提示p53／PUMA有望作為肺纖維化這一頑疾未來治療的潛在藥物靶點。

2 結(jié)語

上述多項研究表明，p53／PUMA通路以多種方式參與調(diào)控了生物體大部分臟器的損傷修復(fù)和纖維化過程；不僅如此，新近研究［30］通過條敲方式還發(fā)現(xiàn)p53／PUMA可調(diào)控多能干細胞傳代，使經(jīng)受DNA損傷的機體細胞繼續(xù)存活，故此推測調(diào)控p53／PUMA通路的信號分子有望成為干細胞治療臟器纖維化疾病的潛在靶點。 綜合前述研究，Slug、ATM、p53、PUMA均可能成為候選靶向分子。當(dāng)然，基于p53自身抑癌基因特性和PUMA調(diào)控凋亡的信號網(wǎng)絡(luò)機制復(fù)雜等情況，合理調(diào)控該通路，使之能真正轉(zhuǎn)化為臨床可用藥物靶點還有待深入研究。相信隨著基礎(chǔ)-臨床實驗的不斷深入，p53／PUMA通路及相關(guān)蛋白在治療器官纖維化方面將會取得突破性進展。

【參考文獻】

［1］Etti IC，Rasedee A，Hashim NM，et al.Artonin E induces p53-independent G1 cell cycle arrest and apoptosis through ROS-mediated mitochondrial pathway and livin suppression in MCF-7 cells［J］.Drug Des Devel Ther，2017，11：865-879.

［2］Mckinley KL， Cheeseman IM.Large-scale analysis of CRISPR／Cas9 cell-cycle knockouts reveals the diversity of p53-dependent responses to cell-cycle defects［J］.Dev Cell，2017，40（4）：405-420.e2.

［3］Sharma G， Rana NK， Singh P， et al.p53 dependent apoptosis and cell cycle delay induced by heteroleptic complexes in human cervical cancer cells［J］.Biomed Pharm a cother，2017，88：218-231.

［4］Nakano K， Vousden KH.PUMA， a novel proapoptotic gene， is induced by p53［J］.Mol Cell，2001，7（3）：683-694.

［5］Hikisz P， Kiliańska ZM.PUMA， a critical mediator of cell death--one decade on from its discovery［J］.Cell Mol Biol Lett，2012，17（4）：646-669.

［6］Follis AV， Chipuk JE， Fisher JC， et al.PUMA binding induces partial unfolding within BCL-xL to disrupt p53 binding and promote apoptosis［J］.Nat Chem Biol，2013，9（3）：163-168.

［7］Li W，Lin S，Li W，et al.Retraction notice to“KDM3A interacted with p53K372me1 and regulated p53 binding to PUMA in gastric cancerl” ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，467（3）：556-561.

［8］Zhou X， Tolstov Y，Arslan A，et al.Harnessing the p53-PUMA axis to overcome DNA damage resistance in renal cell carcinoma［J］.Neoplasia，2014，16（12）：1028-1035.

［9］Yang H，Xie Y，Yang D，et al.Oxidative stress-induced apoptosis in granulosa cells involves JNK， p53 and Puma［J］.Oncotarget，2017，8（15）：25310-25322.

［10］Harder JM，Libby RT.Deficiency in Bim，Bid and Bbc3（Puma） do not prevent axonal injury induced death［J］.Cell Death Differ，2013，20（1）：182-191.

［11］Deshpande SD， Putta S，Wang M，et al.Transforming growth factorβ-induced cross talk between p53 and microRNA in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Diabetes，2013，62（9）：3151-3161.

［12］Samarakoon R， Overstreet JM， Higgins SP， et al.TGF-β1 →SMAD／p53／USF2 → PAI-1transcriptional axis in ureteral obstruction-induced renal fibrosis［J］.Cell Tissue Res，2012，347（1）：117-128.

［13］Daugherity EK， Balmus G， Al Saei A， et al.The DNA damage checkpoint protein ATM promotes hepatocellular apoptosis and fibrosis in a mouse model of non-alcoholic fatty liver disease［J］.Cell Cycle，2012，11（10）：1918-1928.

［14］Roychowdhury S， Chiang D J， Mcmullen M R， et al.Moderate，chronic ethanol feeding exacerbatescarbon-tetrachloride-induced hepatic fibrosis via hepatocyte-specific hypoxia inducible factor 1α［J］.Pharmacol Res Perspect，2014，2（5）：e00061.

［15］Chen CH， Chen MF， Huang SJ， et al.Saikosaponin a induces apoptosis through mitochondria-dependent pathway in hepatic stellate cells［J］.Am J Chin Med，2017，45（2）：351-368.

［16］Chen L， Wang Z， Li S， et al.SFRP2 and slug contribute to cellular resistance to apoptosis inhypertrophic scars［J］.PLoS ONE，2012，7（12）：e50229.

［17］Patel PN， Thennavan A， Sen S， et al.Translational approach utilizing COX-2， p53， and MDM2 expressions in malignant transformation of oral submucous fibrosis［J］.J Oral Sci，2015，57（3）：169-176.

［18］Cha HS， Bae EK， Ahn JK， et al.Slug suppression induces apoptosis via Puma transactivation in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes treated with hydrogen peroxide［J］.Exp Mol Med，2010，42（6）：428-436.

［19］Altin SE， Schulze PC.p53-upregulated modulator of apoptosis（PUMA）： a novel proapoptotic molecule in the failing heart［J］.Circulation，2011，124（1）：7-8.

［20］Feridooni T， Hotchkiss A， Remley-Carr S， et al.Cardiomyocyte specific ablation of p53 is not sufficient to block doxorubicin induced cardiac fibrosis and associated cytoskeletal changes［J］.PLoS ONE，2011，6（7）：e22801.

［21］Gogiraju R， Xu X， Bochenek ML， et al.Endothelial p53 deletion improves angiogenesis and preventscardiac fibrosis and heart failure induced by pressure overload in mice［J］.J Am Heart Assoc，2015，4（2）：e001770.

［22］MANDL A， HUONG PHAM L， TOTH K， et al.Puma deletion delays cardiac dysfunction in murine heart failure models through attenuation of apoptosis［J］.Circulation，2011，124（1）：31-39.

［23］申玲君，張海瑞.無創(chuàng)呼吸機治療特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化合并感染的臨床療效分析［J］.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)電子雜志，2015，2（10）：77-78.

［24］王彥蕊，馬希濤，王思勤，等.特發(fā)性肺纖維化患者肺泡和支氣管上皮細胞凋亡及相關(guān)信號表達［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，30（10）：767-770.

［25］Chuang CY， Liu HC， Wu LC， et al.Gallic acid induces apoptosis of lung fibroblasts via a reactive oxygen species-dependent ataxia telangiectasia mutated-p53 activation pathway［J］.J Agric Food Chem，2010，58（5）：2943-2951.

［26］Bhandary YP， Shetty SK， Marudamuthu AS， et al.Regulation of lung injury and fibrosis by p53-mediated changes in urokinase and plasminogen activator inhibitor-1［J］.Am J Pathol，2013，183（1）：131-143.

［27］Oshikawa K，Sugiyama Y.Serum anti-p53 autoantibodies from patients with idiopathic pulmonary fibrosis associated with lung cancer［J］.Respir Med，2000，94（11）：1085-1091.

［28］Bridges RS， Kass D， Loh K， et al.Gene expression profiling of pulmonary fibrosis identifies Twist1 as an antiapoptotic molecular“rectifier” of growth factor signaling.［J］.Am J Pathol，2009，175（6）：2351-2361.

［29］Wang W，Liu H，Dai X，et al.p53／PUMA expression in human pulmonary fibroblasts mediates cell activation and migration in silicosis［J］.Sci Rep，2015，5（1）：16900.

［30］Li Y， Feng H， Gu H， et al.The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation［J］.Nat Commun，2013，4：2174.