小鼠椎間盤退變模型實驗進展

劉佳鑫，崔 穎，徐海棟

（1新疆維吾爾自治區(qū)昌吉市93864部隊醫(yī)院，新疆昌吉831112；2南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇 南京210002）

0 引言

腰椎間盤突出是一種比較常見的疾病，而且隨著社會節(jié)奏的加快，該病患者人數(shù)每年都有所增長，且呈現(xiàn)出年輕化發(fā)展的趨勢［1］。隨著人年齡的增長，椎間盤會逐漸發(fā)生退變，纖維環(huán)和髓核的含水量逐漸下降，髓核失去彈性，纖維環(huán)逐漸出現(xiàn)裂隙。由于其發(fā)病機制尚不明確，防治手段尤其是預防手段尚不完善。所以，建立有效、成熟的動物模型能夠幫助我們更好地了解和研究該病的發(fā)病機制，并對治療提供新的策略和方法。

因小鼠椎間盤與人類椎間盤在生理結(jié)構(gòu)和病理改變上具有相似性，同時小鼠飼養(yǎng)周期較短，存活率較高，故使用小鼠建立椎間盤退變模型最為理想。本文旨在討論一些近年來常用的、成功率較高的椎間盤退變模型實驗進展。

1 生物力學模型

1.1 去雙前肢直立模型 去雙前肢是指通過手術(shù)或其他方式改變小鼠的活動方式，使其變成與人類相同的雙足直立，以此來改變其脊柱的生物力學狀態(tài)，椎間盤因壓力的增大和方向的變化逐漸發(fā)生退變，這與人類椎間盤退變的機制基本相同。劉盾等［2］將幼鼠雙前肢血管及神經(jīng)束結(jié)扎，然后將肱骨截斷，縫合傷口后繼續(xù)飼養(yǎng)。六月齡時處死并提取椎間盤標本，經(jīng)染色后觀察，髓核出現(xiàn)皺縮，與纖維環(huán)界限不清，椎體表面產(chǎn)生裂痕，軟骨終板出現(xiàn)鈣化，腰椎間盤軟骨細胞發(fā)生變性、壞死，椎間盤高度降低。免疫熒光檢測顯示：CollagenⅠ、CollagenⅩ、TNF-α 陽性細胞比例較正常小鼠均有明顯升高。

1.2 椎間盤加壓模型 通過在小鼠腰椎上直接增大壓力會導致小鼠椎間盤間壓力增大，進而增大了髓核之間的壓力，纖維環(huán)的壓力也隨之增大，當外界壓力超過椎間盤所承受的壓力上限時纖維環(huán)會逐漸發(fā)生破裂，髓核突出并發(fā)生退變。在此壓力增大的基礎上，髓核細胞會發(fā)生凋亡，纖維環(huán)破裂，融媒體的活性相應增加。Lindblom［3］構(gòu)建了世界上最早的椎間盤加壓模型。孫春光等［4］通過手術(shù)方法，以尾椎C5、C6為中心，將兩枚交叉克氏針鉆入尾椎。相繼固定定制碳纖維環(huán)于交叉克氏針上，給予彈簧螺帽固定加壓。壓縮4枚彈簧均為10 mm／kg體質(zhì)量（模擬小鼠直立行走時腰椎所承受的自身體質(zhì)量）彈。術(shù)后兩個月在MRI下發(fā)現(xiàn)椎體間椎間盤信號強度呈低強度改變，椎體周圍纖維環(huán)彎曲變形，椎間盤部位出現(xiàn)壓跡。

生物力學模型其優(yōu)勢在于能很好地模擬人類脊柱的生理特性，使小鼠椎間盤退變符合人類椎間盤退變的過程，可重復性高，可控性強。

2 物理損傷模型

2.1 纖維環(huán)穿刺法 纖維環(huán)穿刺法是目前最常用的動物椎間盤造模方法。通過纖維環(huán)穿刺可以同時損傷纖維環(huán)和髓核，導致椎間盤的高度顯著下降，硬度明顯降低，同時內(nèi)部壓力減?。?］。 Issy 等［6］將 Wistar鼠麻醉后在X線引導下用20 g針經(jīng)皮穿入6-7、8-9尾椎椎間盤。針頭穿過髓核直到對側(cè)纖維環(huán)，然后360°旋轉(zhuǎn)兩次，靜置30 s后拔出。之后，在X線和MRI引導下測量損傷7、30 d后的椎間盤高度。同時使用蘇木素染色和膠原纖維取向進行組織學檢查。最終影像學與組織學評分都能表明椎間盤的顯著退變。Ohnishi等［7］在經(jīng)典纖維環(huán)穿刺的基礎上加以改進，利用Micro-CT對小鼠L4-5椎間盤進行多維平面重建，確定椎間盤上的針刺區(qū)域。為了明確針刺的位置，將椎間盤平面正中的矢狀徑分為三部分，同心橢圓為中心區(qū)（central），外圍被分成腹側(cè)（ventral）和背側(cè)（dorsal）（圖 1）。

圖1 椎間盤平面示意圖

數(shù)周后處死小鼠，通過MRI分析證實針刺椎間盤發(fā)生退變性改變，將針刺部位椎間盤固定、包埋、切片、染色后利用四種經(jīng)典組織學分析方法分析，證明其退變性改變。這種通過針刺損傷中心區(qū)域的方法更有效地損傷纖維環(huán)，導致椎間盤的退變。利用針刺纖維環(huán)建立椎間盤退變模型是一種經(jīng)濟有效、操作簡便、成功率高、重復性好的方法，模型椎間盤的緩慢退變與人類椎間盤退變的發(fā)展規(guī)律相似。

2.2 脊柱失穩(wěn)模型 在脊柱的穩(wěn)定因素中，骨骼和韌帶維持關節(jié)平衡和穩(wěn)定的作用稱為靜力平衡，肌肉維持該作用稱為動力平衡。脊柱失穩(wěn)法是通過手術(shù)切除脊柱的棘突、關節(jié)突、椎板間韌帶等結(jié)構(gòu)，破壞靜力平衡和動力平衡，改變正常脊柱和椎間盤的受力大小和分布，從而間接誘發(fā) IDD發(fā)生。Miyamoto等［8］建立了小鼠的脊柱失穩(wěn)椎間盤模型，主要是咬除棘突組織并同時松解椎旁肌肉組織，對模型行免疫組化及影像學檢查發(fā)現(xiàn)骨贅增生，纖維結(jié)締組織形成，纖維環(huán)破碎。陳德勝等［9］通過切除鼠L1-L6棘突，關節(jié)突，棘上、棘間韌帶，切斷雙側(cè)豎脊肌來破壞脊柱后柱的穩(wěn)定性。在X線下發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組椎間隙狹窄，椎體不穩(wěn)，軟骨終板鈣化。病理示髓核細胞減少，外周纖維環(huán)纖維化樣變。

3 基因敲除模型

相比于手術(shù)方法獲得小鼠椎間盤模型，基因敲除模型具有數(shù)量多，可控性強等優(yōu)點。目前報道的基因敲除模型主要分為兩類，一類是敲除對椎間盤結(jié)構(gòu)決定性的相關基因，例如 Col9a1［10］、雙糖鏈蛋白聚糖［11］。還有一類是對椎間盤正常代謝過程中的相關基因進行敲除，如核苷酸切除修復交叉互補基因（ERCC1）［12］。 DNA 切除修復基因 ERCC1-XPF 的缺失會導致早衰癥或者是疾病的加速進展，影響到皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、肝臟、肌肉骨骼、血液和內(nèi)分泌系統(tǒng)［13］。相似的，Ercc1和 XPF之中任何一個的缺失都會加速小鼠的老化［14-16］，Hernández等［17］將缺乏核苷酸切除修復交叉互補基因和著色性干皮病基因的小鼠模型和野生型老鼠共同飼養(yǎng)，20周后在Micro-CT和X線下進行觀察，發(fā)現(xiàn)缺乏核苷酸切除修復交叉互補基因和著色性干皮病基因的小鼠的椎間盤減少的高度相當于正常兩歲的小鼠，同時會表現(xiàn)出病理性的脊柱后凸，還包括骨礦物質(zhì)減少，椎體多孔性增加。

基因敲除模型是具有廣闊前景的建模辦法，其穩(wěn)定性強，可控性強，可獲得模型數(shù)量較大。但目前由于技術(shù)限制，其所花費的時間和經(jīng)費要多于其他方式。

4 化學損傷模型

Mao等［18］將不同劑量的磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）注入到椎間盤中，4周后在影像學、組織學及免疫組化檢測下提示鼠椎間盤發(fā)生了退變，同時發(fā)現(xiàn)椎間盤退變速度與注入的PBS劑量成正相關。Manuscript［19］將三個月大的小鼠直接暴露于煙草煙霧中來模擬人類的長期吸煙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些小鼠椎間盤內(nèi)蛋白聚糖含量降低，細胞衰老加快，椎體骨質(zhì)疏松、終板孔隙度增大，進而導致椎間盤退變?；瘜W損傷模型雖然易操作，創(chuàng)傷小，但實驗結(jié)果受到單一變量的限制，同時又不符合人類的生理規(guī)律。

5 結(jié)語

以上建模方法是目前使用率和成功率較高的幾種方法，除此之外，汪國宏等［20］還利用人巨細胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）感染小鼠，HE 染色下見椎間盤組織局部灶性淋巴細胞浸潤等慢性炎癥反應，纖維環(huán)板層結(jié)構(gòu)紊亂，關節(jié)軟骨鈣化層增厚，大量黏液及泡沫細胞，軟骨下血管明顯減少，證明了HCMV可以感染小鼠椎間盤組織。動物椎間盤退變模型的建立對于了解人椎間盤的退變機制，對臨床治療和預防人椎間盤退變具有十分重要的的意義。年齡相關導致的變性疾病重要卻充滿了挑戰(zhàn)，因為在人類中受制于研究時間長和樣本量的大小，同時要考慮遺傳和環(huán)境的變量。所以，動物模型的建立在現(xiàn)在以及未來的科研工作中都占據(jù)重要角色。

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