從全身角度對(duì)阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制及預(yù)防與治療初步探索

王延江 卜先樂 向陽 劉雨輝 矯樹生 王慶華 曾凡 金旺盛 王俊 李玲陳陽 張濤 朱潔 鄧娟 姚秀卿 高長越 張莉莉 張猛 許志強(qiáng) 周華東

阿爾茨海默?。ˋD）是臨床最為常見的導(dǎo)致癡呆的神經(jīng)變性病，發(fā)病率高，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，迄今發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，缺乏有效的預(yù)防與治療手段。深入探討阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制、探尋預(yù)防與治療新靶點(diǎn)和新方法是亟待解決的重要問題。我國國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展第十二個(gè)五年規(guī)劃（以下簡稱“十二五”）時(shí)期，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院王延江教授研究團(tuán)體在國家科學(xué)技術(shù)部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題、國家自然科學(xué)基金杰出青年科學(xué)基金和國家自然科學(xué)基金等10余項(xiàng)基金資助下，從中樞和外周兩種途徑探討阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制、干預(yù)靶點(diǎn)、β?淀粉樣蛋白（Aβ）清除途徑和藥物。

一、阿爾茨海默病β?淀粉樣蛋白中樞產(chǎn)生和清除機(jī)制研究

家族性阿爾茨海默病患者腦組織Aβ過度產(chǎn)生系β?淀粉樣前體蛋白（APP）基因突變所致，而對(duì)于占阿爾茨海默病絕大多數(shù)的散發(fā)性阿爾茨海默病患者而言，腦組織Aβ過度產(chǎn)生和沉積的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明［1］。正常老齡化過程中，腦組織神經(jīng)元神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75（p75NTR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以促進(jìn)Aβ產(chǎn)生并介導(dǎo)Aβ神經(jīng)毒性作用，提示p75NTR在散發(fā)性阿爾茨海默病發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們課題組將APP/早老素1（PS?1）轉(zhuǎn)基因小鼠與p75NTR基因敲除小鼠雜交，從而獲得APP/PS?1/p75NTR+和 APP/PS?1/p75NTR?小鼠，免疫組織化學(xué)染色和Western boltting法顯示，Aβ可以促進(jìn)p75NTR過表達(dá)，p75NTR又反過來促進(jìn)Aβ產(chǎn)生，二 者 形 成 正 反 饋 環(huán) 路 ，導(dǎo) 致 A β 過 度 產(chǎn) 生［2］。p75NTR正常代謝過程中釋放p75NTR胞外段（p75ECD），其病理生理學(xué)意義尚不清楚。我們課題組發(fā)現(xiàn)，向APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織注射重組p75ECD，可以競(jìng)爭性阻斷Aβ與p75NTR的正反饋環(huán)路，減少Aβ產(chǎn)生，并具有抑制Aβ聚集、減少Aβ沉積的作用（P＜0.05），表明p75ECD具有抗Aβ聚集和毒性的作用［2］。

我們課題組進(jìn)一步探討p75NTR在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和Western boltting法顯示，阿爾茨海默病患者腦組織p75NTR水平升高、p75ECD水平降低，故p75NTR/p75ECD 比值失衡（P＜0.01）［3］。此后，我們課題組又在APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中轉(zhuǎn)染人p75ECD基因以升高神經(jīng)元p75ECD水平、恢復(fù)p75NTR/p75ECD比值平衡，結(jié)果顯示，小鼠腦組織Aβ產(chǎn)生和沉積減少（P＜0.01），認(rèn)知功能改善（P＜0.01），表明p75NTR/p75ECD比值失衡是阿爾茨海默病患者腦組織Aβ過度產(chǎn)生和沉積的重要機(jī)制［3］。

上述研究從p75NTR/p75ECD比值失衡角度揭示阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制，為疾病預(yù)防與治療研究提供新的靶點(diǎn)。p75NTR/p75ECD比值失衡研究作為封面文章發(fā)表于Mol Psychiatry［3］，并受到美國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)（ASN）前任主席Moses V.Chao教授的專題評(píng)論［4］。

二、阿爾茨海默病β?淀粉樣蛋白外周來源和清除機(jī)制研究

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，阿爾茨海默病患者腦組織Aβ系神經(jīng)元產(chǎn)生，外周系統(tǒng)亦產(chǎn)生 Aβ［5?9］，外源性 Aβ是否參與阿爾茨海默病的發(fā)生尚不清楚。為探討外周系統(tǒng)產(chǎn)生的Aβ在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用，我們課題組將APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠并聯(lián)（parabiosis，系將兩只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過手術(shù)進(jìn)行外科連接的模型，使兩只動(dòng)物的循環(huán)系統(tǒng)合為一體），使得野生型小鼠能夠從APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠獲得穩(wěn)定的Aβ，并聯(lián)12個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的Aβ經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入野生型小鼠腦組織并沉積，形成神經(jīng)炎性斑［NPs，亦稱老年斑（SPs）］、淀粉樣腦血管病（CAA）等阿爾茨海默病特征性病理改變，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元變性死亡，首次證實(shí)外源性Aβ參與阿爾茨海默病的發(fā)生［10］。此后，我們課題組在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病或認(rèn)知功能障礙相關(guān)疾病如慢性腎功能障礙、肝功能障礙、肺功能障礙和慢性感染等患者血清Aβ水平升高［11?14］，提示外周系統(tǒng)功能障礙可能通過影響外周血Aβ水平而參與或促進(jìn)阿爾茨海默病的發(fā)生與發(fā)展。2017年，Nat Rev Neurol對(duì)該項(xiàng)研究進(jìn)行研究亮點(diǎn)介紹［15］。

我們課題組同時(shí)探討腦組織Aβ在外周系統(tǒng)的代謝能力和機(jī)制。共納入30例認(rèn)知功能正常的房室折返性心動(dòng)過速患者，在接受射頻消融（RFA）時(shí)收集不同循環(huán)部位（上腔靜脈、下腔靜脈、股動(dòng)脈）血液，ELISA法檢測(cè)Aβ40和Aβ42水平，結(jié)果顯示，上腔靜脈Aβ水平高于股動(dòng)脈（P＜0.01），下腔靜脈Aβ水平低于股動(dòng)脈（P＜0.05），表明腦組織Aβ通過血液循環(huán)流向外周血而被外周系統(tǒng)清除，揭示人體具有生理性Aβ外周清除機(jī)制［16］。為揭示生理性Aβ外周清除機(jī)制對(duì)腦組織Aβ的清除作用，我們課題組將APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠并聯(lián)，結(jié)果顯示，并聯(lián)后APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織Aβ水平減少68%，根據(jù)公式［外周系統(tǒng)Aβ清除量=并聯(lián)阿爾茨海默病小鼠腦組織Aβ減少量/（并聯(lián)阿爾茨海默病小鼠腦組織Aβ原有量+并聯(lián)阿爾茨海默病小鼠腦組織Aβ減少量）］計(jì)算，APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織約40%的Aβ經(jīng)外周系統(tǒng)清除，表明生理性Aβ外周清除機(jī)制是腦組織Aβ清除的重要機(jī)制［16］。

三、β?淀粉樣蛋白清除途徑和藥物研究

清除腦組織Aβ是預(yù)防與治療阿爾茨海默病的重要策略，既往研究聚焦于藥物進(jìn)入腦組織而發(fā)揮Aβ清除作用，即中樞途徑清除［17］。針對(duì)Aβ的免疫治療是具有代表性的Aβ清除方法，包括接種Aβ疫苗AN1792、靜脈注射抗Aβ抗體和靜脈注射免疫球蛋白（IVIg）。但在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抗Aβ抗體進(jìn)入腦組織可以誘發(fā)自身免疫性腦炎、微血管出血等一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害［18］。我們課題組將抗Aβ抗體與Aβ纖維共孵育，采用硫磺素T（ThT）熒光分析法、透射電子顯微鏡和Western blotting法檢測(cè)抗Aβ抗體對(duì)Aβ纖維的解聚作用，結(jié)果顯示，針對(duì)Aβ氨基末端（N末端）的抗體可以促進(jìn)Aβ纖維解聚為毒性更強(qiáng)的可溶性Aβ寡聚體（P＜0.05），進(jìn)而加重Aβ毒性作用（P＜0.01），并將此種作用命名為“揚(yáng)塵效應(yīng)（dust?raising effect）”［19］。由此可見，中樞途徑清除Aβ存在誘導(dǎo)神經(jīng)損害的潛在作用，因此，外周途徑清除腦組織Aβ成為值得探討的重要研究方向。

我們課題組進(jìn)一步探討外周途徑清除Aβ的策略。分別向APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉組織轉(zhuǎn)染抗Aβ抗體基因和人p75ECD基因，通過降低血清Aβ水平而促進(jìn)腦組織Aβ流向外周血，從而顯著降低腦組織Aβ水平（P ＜ 0.01）［20?22］。腹膜透析常用于清除血液和腦組織有毒物質(zhì)。我們課題組首先探討腹膜透析對(duì)血漿Aβ水平的影響，結(jié)果顯示，接受腹膜透析的慢性腎功能衰竭患者在腹膜透析后血漿Aβ水平顯著降低（P＜0.001）。為進(jìn)一步探討腹膜透析對(duì)腦組織Aβ水平的影響，我們課題組通過手術(shù)方法建立APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠腹膜透析模型，同時(shí)采用微透析技術(shù)對(duì)接受腹膜透析的小鼠進(jìn)行腦組織動(dòng)態(tài)微量生化取樣，獲得可以反映腦組織可溶性Aβ水平的樣本，結(jié)果顯示，腹腔透析在清除血漿Aβ的同時(shí)亦可有效清除腦組織可溶性Aβ（P＜0.001），長期腹腔透析可以有效清除小鼠腦組織Aβ（P＜0.01）、改善認(rèn)知功能（P＜0.05）［23］，證實(shí)外周途徑清除腦組織Aβ的有效性。我們課題組提出外周途徑清除Aβ的阿爾茨海默病預(yù)防與治療新策略［24］。2017年，Nat Rev Neurol對(duì)此項(xiàng)研究進(jìn)行專題介紹，認(rèn)為外周途徑清除Aβ是一項(xiàng)有前景的阿爾茨海默病預(yù)防與治療途徑［25］。

抑制Aβ聚集是清除Aβ的重要策略。我們課題組予月齡3個(gè)月的APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠葡萄籽多酚口服9個(gè)月，采用免疫組織化學(xué)染色和ELISA法檢測(cè)腦組織Aβ水平，結(jié)果顯示，服用葡萄籽多酚可以明顯降低小鼠腦組織Aβ水平（P＜0.05）［26］；進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)分析解析出兒茶酚基團(tuán)是上述天然多酚抗氧化應(yīng)激和抑制Aβ聚集的共同基團(tuán)［27］，提示可以從抗氧化劑中探尋新型抗Aβ聚集藥。依達(dá)拉奉是臨床用于急性缺血性卒中的氧自由基清除劑，我們課題組發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉具有較強(qiáng)的抑制Aβ聚集作用，并進(jìn)行依達(dá)拉奉預(yù)防與治療阿爾茨海默病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，予APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射或口服依達(dá)拉奉，結(jié)果顯示，兩種方法均可以有效抑制腦組織Aβ沉積（P＜0.01），減輕氧化應(yīng)激和神經(jīng)元變性死亡（P ＜0.01），改善認(rèn)知功能（P ＜0.05）［28］。阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制涉及腦組織Aβ沉積、氧化應(yīng)激等多個(gè)病理環(huán)節(jié)，應(yīng)協(xié)同干預(yù)?？寡趸瘧?yīng)激和抑制Aβ聚集共同基團(tuán)的揭示，為阿爾茨海默病多靶點(diǎn)協(xié)同藥物研發(fā)提供新的思路。鑒于此我們課題組提出阿爾茨海默病預(yù)防與治療應(yīng)采用綜合干預(yù)的策略［29］。

我們課題組對(duì)阿爾茨海默病Aβ中樞和外周清除機(jī)制以及清除途徑和干預(yù)靶點(diǎn)進(jìn)行初步探討，發(fā)現(xiàn)Aβ中樞和外周清除機(jī)制共同參與疾病的發(fā)生與發(fā)展，二者均是潛在的阿爾茨海默病干預(yù)靶點(diǎn)。據(jù)此我們課題組提出阿爾茨海默病系統(tǒng)觀［30］，為從全身角度探討阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制及診斷與治療策略提供新的思路。

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