微生物檢定法測定乙酰螺旋霉素片含量的不確定度評定

宋玉霞 田妮娜

（1 河西學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2 蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730000）

乙酰螺旋霉素片是一種廣譜抗菌藥，可有效抵御由金黃色葡萄球菌、肺炎球菌等引起的感染。目前報道的其含量測定的方法有紫外分光光度法[1]、管碟法（《中國藥典》2005年版）以及比濁法[2]等，但是這些方法存在專屬性差、測量結(jié)果誤差大、操作復(fù)雜、耗費時間長等缺點，《中國藥典》（2015年版）[3]采用微生物檢定法測定其含量。

不確定度是一種表征合理賦予被測量值的分散性，與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)[4]。微生物測定的不確定度主要考慮的是A類評估，相對而言，B類評估的因素較少[5]。郜振華[6]等對乙酰螺旋霉素片含量測定的不確定度進行評定，但是只對供試品及標準品制備過程，以及微生物鑒定和結(jié)果重復(fù)性所帶來的不確定度進行評定，不確定度分量并不夠細化。為了在測量結(jié)果的表達和質(zhì)量評定等方面更為準確，本實驗根據(jù)JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》對微生物檢定法測定乙酰螺旋霉素片含量的不確定度進行了測量和評定，為評價該方法的準確性和可靠性提供依據(jù)。

1 材 料

ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)司），Mettler MS205DU電子天平（梅特勒-托利多），恒溫恒濕培養(yǎng)箱（德國HCP153Memmert）。乙酰螺旋霉素標準品（中檢院，效價測定用，S對1324 U/mg，批號：130347-201304）。乙酰螺旋霉素片樣品（甘肅蘭藥藥業(yè)有限公司，批號：20150203，抗生素Ⅱ號培養(yǎng)基（7.8-8.0，批號130916），菌種：枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501）。

2 方 法

2.1 標準品溶液的制備：精密稱取乙酰螺旋霉素標準品0.01881 g（W對），置于25 mL的容量瓶中加乙醇8 mL使其溶解，然后用滅菌水稀釋并定容至刻度，搖勻，得溶液為996.1776 U/mL。精密吸取2 mL，用磷酸鹽緩沖液（pH7.8）稀釋至50 mL，搖勻，即得SH；再精密吸取溶液2 mL，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）稀釋至100 mL，搖勻，即得SL。

2.2 樣品溶液的制備：取乙酰螺旋霉素片20片（W總重：5.1990 g，則W平均：0.2600 g），精密稱取細粉0.25984 g（W樣），置于100 mL的容量瓶中，加乙醇40 mL使溶解，然后用滅菌水稀釋并定容至刻度，搖勻，得溶液為999.3846 U/mL。同法得TH和TL。

2.3 雙碟的制備與培養(yǎng)：取平底雙碟12套，分別加入加熱融化的培養(yǎng)基20 mL，凝固后作為底層。另取加熱融化后的培養(yǎng)基適量，放于50 ℃的水浴鍋中至恒溫， 加入枯草芽孢桿菌菌懸液適量，每一雙碟中分別加入5 mL，作為菌層。冷卻后，每一雙碟中以等距離安置不銹鋼小管4個，待用。將上述稀釋好的標準品溶液與樣品溶液分別滴加于不銹鋼小管內(nèi)，在36 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

2.4 抑菌圈直徑的測定與效價計算：取出培養(yǎng)好的雙碟，用抑菌圈測量儀測量各個抑菌圈的直徑， 照生物檢定統(tǒng)計法進行可靠性檢驗與效價計算。D值＝標準品溶液濃度/供試品溶液濃度＝996.1776/999.3846＝0.9968；估計效價At＝100000 U/mg；劑間比：2。

掃描抑菌圈得可靠性檢驗：直線回歸和劑間非常顯著（P＜0.01）與偏離平行不顯著（P＞0.05），可信限率為4.8%，樣品的測定效價（Pt）為98403.6247 U/mg。供試品中乙酰螺旋霉素為標示量的98.4%。

3 不確定度評定

3.1 測量模型：采用二劑量法，通過數(shù)學(xué)模型對乙酰螺旋霉素的含量測定進行分析，以找出不確定度因素。含量%=Pt/At×100%；效價Pt＝At×D×log-1[0.301×（T2+T1-S2-S1）/（T2+S2-S1-T1）]

式中，T2～12個雙碟高濃度供試品溶液抑菌圈直徑的總和（mm）；T1～12個雙碟低濃度供試品溶液抑菌圈直徑的總和（mm）；S2～12個雙碟高濃度標準品溶液抑菌圈直徑的總和（mm）；S1～12個雙碟低濃度標準品溶液抑菌圈直徑的總和（mm）；Cs-標準品溶液濃度；Ct-供試品溶液濃度；W對-標準品稱量（mg）；S對-標準品的效價（1324 U/mg）；f樣-樣品的稀釋倍數(shù)；W平均-平均片重（g）；W樣-樣品稱量（g）；f對-標準品的稀釋倍數(shù)；常數(shù)-0.301為二劑量法劑間濃度比的對數(shù)值。

3.2 測定不確定度識別：見表1。

3.3 量化不確定度

3.3.1 抑菌圈直徑值的不確定度：對抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，根據(jù)效價公式計算效價（Pt）為98403.6247 U/mg，同時統(tǒng)計分析得自由度， 其合并樣本標準差即標準不確定度u（x1）為0.209，則相對標準不確定度為u（x1）rel=u（x1）/Pt=2.13×10-6。

3.3.2 抑菌圈測量儀的不確定度：抑菌圈測量儀的最大允許誤差為±0.02 mm，服從均勻分布，其標準不確定度u（x2）為0.0115 mm。抑菌圈測量儀的標準圈直徑（x）為19 mm，則urel（x2）＝u（x2）/x＝0.0115/19＝6.1×10-4。

3.3.3 試驗設(shè)計的不確定度：供試品中的乙酰螺旋霉素片的效價為98.4%，測定效價的平均可信限率為4.8%，因置信概率為95%，其包含因子K=1.96，urel（x3）＝0.048/1.96＝2.5×10-2。

3.3.4 標準品稱量的不確定度：標準品稱量的不確定度包括：①天平稱重重復(fù)性的不確定度，使用天平對一質(zhì)量恒定的物體（約20 mg）反復(fù)稱重10次，其標準偏差為0.0193 mg，屬A類不確定度。②稱重儀器的不確定度，使用的天平（d＝0.01 mg）由檢定證書得到天平的最大允許誤差為±0.15 mg，屬B類不確定度，服從均勻分布，其標準不確定度0.087 mg，通常稱取物質(zhì)時經(jīng)二次獨立稱量，計算得天平校準的標準不確定為0.123 mg。③天平示值的不確定度，使用的天平（d＝0.1 mg）對示值（分辨率）導(dǎo)致的不確定服從均勻分布，天平分辨率為屬B類不確定度，天平分辨率為0.01mg，區(qū)間半寬a=0.005 mg，其標準不確定度為0.0029 mg。則標準品稱量的合成不確定度uc（W對）為6.9×10-3。

表1 測定不確定度識別表

3.3.5 標準品溶液和供試品溶液稀釋的不確定度：標準品溶液和供試品溶液稀釋的不確定度包括①標準品溶液稀釋重復(fù)性的不確定度，標準品稀釋過程中用到25、50、100 mL容量瓶，2 mL移液管重復(fù)10次，屬A類不確定度，計算其標準偏差分別為0.017、0.019、0.022、0.0037mL。供試品稀釋過程中用到100、50、100 mL容量瓶，2 mL移液管10次，屬A類不確定度，計算其標準偏差分別為0.025、0.017、0.023、0.0040 mL。②量取定容容器引入的不確定度，根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》查得，A等品25 mL（1次）、50 mL（1次）、100 mL（1 次）、容量瓶、2 mL（2次）移液管的最大允許誤差分別為±0.03、±0.05、±0.10、±0.010mL，屬B類不確定度，服從三角分布，包含因子為，則5個容器的標準不確定度分別為0.00409 mL。③溫度引起的不確定度，因為標準品溶液和供試品溶液是在相同條件下制備，溫差和溶劑的膨脹系數(shù)相同，溫度引起的相對不確定度可忽略。則25 mL容量瓶、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶、2 mL移液管體積的相對標準不確定度分別為urel（v25）＝8.4×10-4；urel（v50）= 5.6×10-4；urel（v100）=4.7×10-4；urel（v2）=5.6×10-3。則標準品溶液稀釋的相對合成不確定度urel（f對）=5.8×10-3；標準品溶液稀釋的相對合成不確定度urel（f對）=5.9×10-3。

3.3.6 標準品效價引起的不確定度：乙酰螺旋霉素標準品效價的最大允許誤差一般認為是±1%，因置信概率為95%，其包含因子K=1.96，標準品效價相對標準不確定度urel（S對）=0.01/1.96=5.2×10-3。

3.3.7 供試品稱量的不確定度：供試品稱量的不確定度也包括：①天平稱重重復(fù)性的不確定度，使用天平對一片供試品反復(fù)稱重10次，計算其標準偏差為0.0249 mg，屬A類不確定度。②稱重儀器的不確定度和天平示值的不確定度引入的不確定度見3.3.4，則供試品稱量的合成不確定度uc（W樣）=0.13 mg，ucrel（W樣）=5.0×10-4。

3.3.8 平均片重的不確定度：平均片重的不確定度主要包括：①天平稱重重復(fù)性的不確定度，,使用天平對20片供試品反復(fù)稱重10次，計算其標準偏差為0.149mg，屬A類不確定度。②稱重儀器的不確定度，使用的天平（d＝0.1 mg）由檢定證書得到天平的最大允許誤差為±1.0 mg，屬B類不確定度，服從均勻分布，其標準不確定度為1.0/√3 ＝0.577 mg，通常稱取物質(zhì)時經(jīng)二次獨立稱量，計算得天平校準的標準不確定為0.82 mg。③天平示值的不確定度，使用的天平（d＝0.1 mg）對示值（分辨率）導(dǎo)致的不確定服從均勻分布，天平分辨率為屬B類不確定度，天平分辨率為0.1 mg，區(qū)間半寬a=0.05 mg，其標準不確定度為供試品稱量的合成不確定度uc（W平均）= 1.7×10-4。

3.4 總合成標準不確定度uc（x）：總合成相對標準不確定度ucrel（x）＝

3.5 擴展不確定度U和報告結(jié)果：結(jié)果符合正態(tài)分布，在置信水平為95%時，包含因子K＝2，擴展不確定度：U＝K×uc（x）＝2×2.8%＝6%。因此，本品含乙酰螺旋霉素為（98.4±6）%。

4 討 論

本實驗根據(jù)不確定度理論對抑菌圈直徑值X1、抑菌圈測量儀X2、實驗設(shè)計X3、標準品稱量W對、標準品的效價S對、標準品溶液稀釋f對、供試品稱量W樣、平均片重W平均、供試品溶液稀釋f樣等9項進行不確定度評定。并在95%的置信區(qū)間下，得出本方法所測質(zhì)量分數(shù)結(jié)果的擴展不確定度為K×uc（x）＝6%，結(jié)合實驗過程及計算結(jié)果可知，微生物鑒定法測定乙酰螺旋霉素含量的不確定度主要來源為實驗方法設(shè)計，其次為抑菌圈的測量、標準品溶液和供試品溶液的制備。實驗表明選擇適宜的實驗方法設(shè)計，可有效減小試驗的不確定度，其次實驗過程中的稀釋、稱量等操作過程對測量結(jié)果的不確定度影響也較大。

本實驗對微生物檢定法測定乙酰螺旋霉素片含量的方法進行分析，建立微生物檢定法測定乙酰螺旋霉素片的含量不確定度計算的數(shù)學(xué)模型。通過對各變量的分析，計算各變量的不確定度，最后計算出合成標準不確定度。結(jié)果表明采用該方法建立的數(shù)學(xué)模型可用于測定乙酰螺旋霉素片微生物檢定法含量檢測中的不確定度估算。為評價該方法的準確性和可靠性提供依據(jù)。

[1] 賀麗娜,李世頌.紫外分光光度法測定乙酰螺旋霉素片的含量[J].佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1998,21(1)：45.

[2] 董幫興,劉紅,汪玉萍.比濁法測定乙酰螺旋霉素片的含量[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2008,24(3)：333-334.

[3] 中國藥典2015年版[M].二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[4] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJF 115-2005化學(xué)分析測量部確定度評定[S].北京：中國計量出版社,2005.

[5] 陸明,范國榮,汪洋,等.測量不確定度在藥品檢測領(lǐng)域的研究進展[J].中國藥事,2013,27(5)：485-492.

[6] 郜振華,郜建華.乙酰螺旋霉素片含量測定不確定度評定[J].中外醫(yī)療,2009,28(17)：116-119.