山羊精液冷凍保存技術(shù)研究進(jìn)展

呂玉華,廖榮榮,林月霞

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106）

山羊是人類最早馴化的家畜品種之一，可以為人類提供高營養(yǎng)的肉類和御寒用的皮毛。山羊肉是一種高品質(zhì)的健康食品，膽固醇含量低，人類所必需的氨基酸含量高。隨著生活水平的提高，山羊肉的消費(fèi)需求越來越大。目前，國家正大力提倡發(fā)展草食動物養(yǎng)殖業(yè)，作為主要的草食動物之一，山羊養(yǎng)殖規(guī)模隨著需求增加而不斷擴(kuò)大。隨著肉羊的規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖的推廣，對優(yōu)質(zhì)山羊冷凍精液的需求也越來越大，使用山羊冷凍精液及人工授精技術(shù)可以極大地促進(jìn)優(yōu)秀種公羊的推廣與利用，改善羊群結(jié)構(gòu)，從而降低養(yǎng)羊生產(chǎn)成本，提高養(yǎng)殖收益。

精液稀釋后在常溫（15—25℃）條件下僅可保存數(shù)天，而在冷凍（-79℃或-196℃）條件下則可長期保存。近年來，精液冷凍保存技術(shù)得到了長足的發(fā)展，如在冷凍保存方法的改進(jìn)和冷凍稀釋液的完善等方面［1］，凍精復(fù)蘇后的活力有了極大的提升，受精能力也得到了很大的提高。但冷凍保存仍然存在諸如冷凍精液精子活力不高和頂體完整率低等問題。本文從山羊冷凍精液稀釋液的理化指標(biāo)、稀釋液添加劑和冷凍保存方法等方面對影響山羊冷凍精液質(zhì)量的因素進(jìn)行綜述，以期為山羊精液冷凍保存技術(shù)更好地應(yīng)用于肉用山羊養(yǎng)殖提供參考。

1 山羊精液冷凍保存

1.1 精液冷凍保存研究歷史

山羊精液冷凍保存，即將優(yōu)秀種公羊的精液置于超低溫環(huán)境中保存，使精子的新陳代謝達(dá)到或接近停滯狀態(tài)，待到使用時，通過復(fù)蘇使精子復(fù)活并有比較強(qiáng)的受精能力。精液冷凍保存技術(shù)可以大大促進(jìn)優(yōu)秀種公羊的推廣與利用，也可以減少大量飼養(yǎng)種公畜所需的高昂成本，并能有效地避免疾病通過生殖渠道傳播。

人類很早就開始了精液冷凍技術(shù)的嘗試，但直到20世紀(jì)40年代后，家畜精液冷凍技術(shù)才得到較快發(fā)展。Smith等［2］使用甘油進(jìn)行了美利奴羊精液的低溫冷凍保存研究。山羊精漿中含有特殊的蛋黃凝結(jié)酶，沖洗離心法處理山羊精液去除精漿，可減少磷脂酶或類磷脂酶等對精子的損害，這對山羊精液冷凍保存貢獻(xiàn)很大［3］。Tuli等［4］從冷凍精液復(fù)蘇溫度著手，研究了復(fù)蘇溫度對波爾山羊精子運(yùn)動能力及谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶釋放的影響，發(fā)現(xiàn)冷凍精液在70℃復(fù)蘇7 s的效果最好。此外，研究人員還從采精方法［5］和精液的冷凍保存溫度、降溫速率［6］、冷凍稀釋液的理化指標(biāo)［7］、冷凍保護(hù)劑［8-10］等方面探討了精液冷凍保存技術(shù)。

1.2 存在的主要問題

山羊精液冷凍保存是家畜種質(zhì)資源保存的一個特殊挑戰(zhàn)，其主要原因是缺乏最理想的山羊精液冷凍保存準(zhǔn)則。精液的冷凍保存是先將精液與稀釋液按配比混合并保存在超低溫冰箱或者液氮中，冷凍保存所用的稀釋液以及稀釋液中所添加的保護(hù)劑等都很重要［11］，稀釋液的一個重要作用是降低精子在冷凍降溫和復(fù)蘇解凍過程中受低溫?fù)p傷的程度。

山羊體內(nèi)分泌的脂肪酶可以和蛋黃脂質(zhì)或脫脂乳的甘油三酯結(jié)合，產(chǎn)生對精子細(xì)胞有害的物質(zhì)。當(dāng)前常用方法是用離心法去除精清（也叫精子清洗），但該步驟費(fèi)時且繁瑣，并有可能導(dǎo)致精子細(xì)胞的丟失或損傷。盡管在山羊精液冷凍保存方法的改進(jìn)、冷凍稀釋液的完善等方面取得了很大的進(jìn)步［12］，凍精復(fù)蘇后的活力有了極大的提升，凍精的受精能力也得到了比較大的提高，但山羊精液冷凍保存仍然存在諸如冷凍精液復(fù)蘇后精子活力不夠高、頂體完整率較低、精子畸形率較高以及凍精的受精能力不足等問題［13］。因此，與鮮精相比，山羊凍精的利用率仍然比較局限。冷凍保存過程中一系列的生理生化反應(yīng)及分子機(jī)制還有待更深入的研究，以促進(jìn)精液冷凍保存技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

2 稀釋液的理化指標(biāo)對冷凍精液的影響

作為精液冷凍保存的媒介，精液稀釋液的主要作用是降低精子在冷凍降溫和復(fù)蘇解凍過程中受低溫和冰晶損傷的程度，并給精子提供合適的環(huán)境。稀釋液應(yīng)具有緩沖性和低溫保護(hù)性能，還應(yīng)該是水溶性的且不能滲透細(xì)胞膜。適宜的冷凍精液稀釋液對精液冷凍至關(guān)重要。此外，稀釋液還必須要符合精子的生物學(xué)特性，其中pH和滲透壓是制備精液冷凍稀釋液需注意的兩個主要理化指標(biāo)。

2.1 pH

精液pH的異常波動將會導(dǎo)致精子損傷甚至死亡。精清的一個重要作用就是為精子提供緩沖以對抗pH的波動，而在體外進(jìn)行山羊精液冷凍保存時精清已被去除，因此，為了維持冷凍精子的活力和受精能力，必須控制好冷凍稀釋液的pH。山羊鮮精的pH是7.2—7.5，此時精子的氧氣攝入量最大，而精子的運(yùn)動能力在pH 7.0—7.2時最理想。通常，山羊精液稀釋液的pH為6.0—7.5，但不同科研人員對pH的范圍存在不同見解。

稀釋液的pH隨著冷凍保存時間延長逐漸降低，而冷凍保存精子的活率和稀釋液的pH呈強(qiáng)相關(guān)。稀釋液中添加葡萄糖時，精子可以此為能量進(jìn)行代謝并產(chǎn)生弱酸性的乳酸鹽［14］。蛋黃可以增強(qiáng)精子對pH變動的耐受力，如果稀釋液中含有蛋黃或奶粉，則一般建議pH在6.25—6.8。

對于精液冷凍保存，常通過降低精液稀釋液的pH使精子處于弱酸性環(huán)境，這樣既不會危害精子，又可以有效抑制精子運(yùn)動，從而有利于精子的保存?？梢?，維持稀釋液恒定的pH對于保持精子活力和受精能力有著重要意義。

2.2 滲透壓

山羊精子在含不同種糖類、鹽類和緩沖劑的冷凍稀釋液中都可以生存，但稀釋液的滲透壓只可在一個很小的范圍內(nèi)浮動。高滲的冷凍稀釋液更適合于山羊精液冷凍保存。通過使用含濃縮蔗糖的稀釋液，F(xiàn)arshad等［15］認(rèn)為山羊精子在冷凍階段可以耐受560 mOsm的滲透壓。Salamon等［16］研究表明，用以Tris堿和檸檬酸葡萄糖為主要成分的稀釋液時，山羊精子所耐受的最佳滲透壓是540 mOsm。此外，有研究指出，相對于325 mOsm和625 mOsm的滲透壓，山羊精子在滲透壓為425—525 mOsm的冷凍稀釋液中的損傷更低［17］?？傊?，冷凍稀釋液的主要成分和濃度不同，其滲透壓可以有一定的范圍變動，根據(jù)已有的研究結(jié)果，冷凍稀釋液的滲透壓在425—560 mOsm時對山羊精子的冷凍保存效果最好。

3 添加劑對山羊冷凍精液的影響

山羊精液冷凍稀釋液主要包含有非滲透性防凍劑（奶粉或蛋黃）、滲透性防凍劑（甘油、乙二醇、二甲亞砜）、緩沖液（Tris或者Test）、一種或多種糖類、鹽類（檸檬酸鈉或檸檬酸）和抗生素。稀釋液成分和含量對精子保護(hù)起著決定性的作用。研究指出，甘油［15］、維生素［6］、卵黃［3］等添加劑對精子有重要的保護(hù)作用。

3.1 冷凍保護(hù)劑

甘油是當(dāng)前最常用的一種冷凍保護(hù)劑。甘油作為一種主要的滲透性抗冷凍保護(hù)劑，是精液冷凍保護(hù)里程碑式的發(fā)現(xiàn)，其可以保護(hù)精子在降溫、冷凍和復(fù)蘇過程中少受低溫的傷害［2，15］。

Anakkul等［18］研究表明，冷凍稀釋液中10%的甘油添加使得解凍后的精子可以使母羊有60%的懷孕率。甘油的添加方式也關(guān)系到冷凍保存效果，在冷卻到4℃時，以10 min為間隔分3次添加甘油的保存效果最好。

滲透性保護(hù)劑的最終添加比例取決于該物質(zhì)對精子的保護(hù)作用及其自身毒性的大小。甘油濃度不宜過高，因?yàn)榫禹旙w損傷率會隨著甘油濃度增加而上升。不同研究人員使用的甘油添加量在3%—10%，而稀釋精液中4%—7%的添加是最理想的［17］。

有研究表明，二甲乙酰胺是比甘油更好的抗氧化防凍劑，將10μmol/L和20μmol/L的櫟精分別添加到含5%二甲乙酰胺和甘油的稀釋液中，然后進(jìn)行山羊精液的冷凍保存與復(fù)蘇。通過對精子的活力參數(shù)、運(yùn)動性、不正常比、膜完整性和脂質(zhì)過氧化等進(jìn)行檢測，最終得出二甲乙酰胺的抗凍效果比甘油好［19-20］。

3.2 維生素

在正常代謝條件下，精子會產(chǎn)生一系列的活性氧簇（ROS），而正常情況下精子產(chǎn)生的ROS和抗氧化劑能達(dá)到一個平衡，從而有效防止高濃度的ROS引起細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至壞死［21］。在精液冷凍和解凍過程中，這種平衡被打破，為避免精液冷凍和解凍過程中ROS和自由基的危害，需在精液冷凍稀釋液中添加抗氧化劑以有效地保護(hù)精子對抗這種危害。

維生素E是精子抗氧化系統(tǒng)的主要組成部分，也是質(zhì)膜對抗ROS的主要保護(hù)劑。冷凍稀釋液中添加適當(dāng)濃度的維生素E可以有效減緩冷凍對精子的傷害，提高和田羊解凍后精子活率，并改善冷凍精液品質(zhì)［22］。此外，在稀釋液中添加2.5—8.5 mg/mL的維生素C可以有效提高精子活率以及頂體和質(zhì)膜的完整性［6］。

維生素E和維生素C是重要的抗氧化劑，可以通過抑制自由基的形成，阻止自由基對精子膜脂質(zhì)的過氧化，從而維持精子頂體質(zhì)膜的完整性，提高解凍后精子頂體完整率和精子活率，最終達(dá)到提高受精率的目的［23-26］。

3.3 蛋黃

蛋黃是哺乳動物精液冷凍稀釋液中重要的非滲透性防凍劑。山羊精液冷凍保存使用蛋黃作防凍劑，首先要解決精漿中蛋黃凝結(jié)酶（EYCE）的問題，因?yàn)镋YCE酶可將蛋黃中的卵磷脂水解為溶血磷脂類物質(zhì)，而這種物質(zhì)對精子具有毒副作用［26］。所以，山羊精液冷凍保存前都要先離心去除精漿。

對于蛋黃的添加濃度，有研究指出在含葡萄糖和EDTA的稀釋液中，20%的蛋黃添加使得凍后精子的活力和質(zhì)膜完整性顯著差于2.5%的添加組，從而得出低濃度（2.5%）的蛋黃添加更有利于山羊精子凍后活性和繁殖力［3］。劉亮等［27］研究顯示，崇明白山羊精液冷凍保存稀釋液中添加20%雞蛋黃的效果比添加20%鵪鶉蛋黃更顯著，解凍后的精子活力提高近10%。在以Tris為緩沖液的稀釋液中，20%的蛋黃添加比不同濃度卵磷脂添加的凍后精子參數(shù)及受精胚胎發(fā)育更好［28］。

3.4 其他添加劑

除甘油、維生素E、維生素C和蛋黃等物質(zhì)外，還有許多其他物質(zhì)可用作精液冷凍稀釋液的添加劑，如大豆提取物、膽固醇、氨基酸和番茄紅素等［29］。

番茄紅素作為一種抗氧化劑，可有效提高精子細(xì)胞中抗氧化酶的活性，提高凍精復(fù)蘇后精子活率。稀釋液中添加番茄紅素1 mg/mL，可以有效提高解凍后精子的活力、線粒體活性、DNA和染色體完整性等指標(biāo)［29-30］。

環(huán)糊精膽固醇包合物（Cholesterol-loaded cyclodextrin，CLC）是新發(fā)現(xiàn)的可用于山羊精子冷凍保存的添加劑，可提高冷凍山羊精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性［9］。未去除精漿時，CLC可以有效地保護(hù)精子少受來自精漿的損害。

大豆提取物（主要是大豆卵磷脂）作添加劑可以有效地保護(hù)精液，能極大地降低冷凍保存對精子活力的損傷，同時可以省去繁瑣且耗時較多的山羊精液冷凍所需的精漿去除步驟，可以作為蛋黃的有效替代物［31-33］。此外，由于其價格相對低廉，且不含動物源性病毒，大豆提取物更適宜用于規(guī)?；瘍鼍a(chǎn)實(shí)踐。膽固醇在精子質(zhì)膜流動性、冷刺激敏感性和冷凍損傷等方面起著重要的作用，膽固醇的添加可以有效地提高凍后精子活力和精子受精力，特別是在有蛋黃存在時，膽固醇的保護(hù)效果最好［12］。此外，稀釋液中添加氨基酸也可以提高冷凍精子的凍后活力［34］。

4 冷凍保存方法對精液冷凍保存的影響

4.1 精漿處理

精漿是精液中的液體成分，山羊的精漿含有特殊的蛋黃凝結(jié)酶（EYCE），因?yàn)镋YCE酶可與脫脂乳或蛋黃反應(yīng)，產(chǎn)生對精子具有損害作用的物質(zhì)，所以，進(jìn)行山羊精液的冷凍保存首先要將精漿去除。去除精漿是一個費(fèi)時且繁瑣的步驟，還會造成精子細(xì)胞的丟失或者損傷。Salmon等［9］提出了一種新的山羊精液冷凍保存方法，即直接進(jìn)行冷凍保存而不去除精漿。該方法是在稀釋液中添加3 mg/mL的環(huán)糊精膽固醇包合物（CLC），CLC可提高冷凍保存山羊精子膜的穩(wěn)定性，并且在未去除精漿時，CLC可以有效地保護(hù)精子少受來自精漿的損害。此外，使用大豆提取物（主要是大豆卵磷脂）作為添加劑也可以省去繁瑣耗時的精漿去除步驟，并可以有效地保護(hù)精子，能極大地降低冷凍保存對精子活力的損傷［33］。

4.2 精液冷凍保存方法

精液冷凍保存主要有顆粒法和細(xì)管法，顆粒法保存比較方便快捷便宜，但不利于系統(tǒng)化管理，而細(xì)管法易于標(biāo)記且適合系統(tǒng)化管理，是當(dāng)前冷凍精液保存的主流方法。兩種方法都需先將精液冷卻到4—5℃平衡1.5—4 h，顆粒法是將0.1—3 mL的精液滴到有鋸齒的干冰（-79℃）中，再平衡2—4 min，最后將精液顆粒投入液氮中保存；在細(xì)管法中，稀釋精液經(jīng)4℃平衡后用0.25 mL或0.5 mL的細(xì)管分裝，在距離液氮表面2—4 cm處熏蒸7—8min，最后投入液氮中保存［9］。目前，已經(jīng)有針對細(xì)管法生產(chǎn)的控溫儀、全自動精液分裝機(jī)和細(xì)管打印機(jī)，細(xì)管法精液冷凍已經(jīng)成功進(jìn)行了商業(yè)化生產(chǎn)。

對精液冷凍保存的研究顯示，熏蒸距離越近，熏蒸時間應(yīng)縮短，熏蒸距離越遠(yuǎn)，熏蒸時間應(yīng)相應(yīng)延長。研究表明，最佳熏蒸距離是2 cm和熏蒸時間為7 min，解凍后的精子活力為42.33±3.96［35］。又有研究指出，熏蒸高度應(yīng)該由細(xì)管尺寸決定，0.5 mL的細(xì)管應(yīng)該在4 cm處熏蒸5 min，而0.25 mL的細(xì)管則在16 cm處熏蒸2 min即可。

冷凍保存的精液在使用時需要先復(fù)蘇，而復(fù)蘇過程對精子復(fù)活率的影響很大。凍精的復(fù)蘇主要是將凍精麥管置于溫水中融解。有研究指出，相對于在38℃溫水中融解60 s，凍精麥管在60℃熱水中融解7 s可以有效地提高復(fù)蘇精子細(xì)胞膜功能完整率［35］?？梢姡诟邷厮锌焖偃诮饪梢越档驮俳Y(jié)晶現(xiàn)象對凍精的傷害。

5 結(jié)論與展望

精液冷凍保存技術(shù)的快速發(fā)展，使得精液的利用突破時間、地域和種公羊等限制成為可能，同時也有利于山羊種質(zhì)資源保存。聯(lián)合使用精液冷凍技術(shù)和人工授精技術(shù)，可以極大地提高優(yōu)良種公羊的利用率，加速品種的育成和改良步伐。

然而，影響山羊精液冷凍的因素很多，如保存方法、保存溫度、冷凍速率、稀釋液的化學(xué)成分、冷凍保護(hù)劑的種類及濃度等。精子質(zhì)膜富含多聚不飽和脂肪酸，這會使精子在低溫過程中變得對ROS很敏感，所以，需要在冷凍稀釋液中添加維生素E和維生素C等抗氧化劑。隨著山羊精液冷凍技術(shù)和人工授精技術(shù)的發(fā)展，使用凍精的母羊情期受胎率將越來越高。

精液冷凍保存與復(fù)蘇是復(fù)雜的生理生化過程，這個過程給精子帶來的損傷主要有物理性損傷、化學(xué)性損傷和氧化應(yīng)激損傷，這些損傷對復(fù)蘇后精子完整性和精子活力等指標(biāo)有深刻影響，這也是山羊精液冷凍保存技術(shù)推廣受限的主要因素。精液冷凍對精子印記基因DNA甲基化等表觀遺傳以及相關(guān)基因表達(dá)都會有較大的影響。總之，精子在冷凍保存過程中復(fù)雜的分子變化以及復(fù)蘇后繁殖力的差異，其機(jī)制還不是很明確，還需要進(jìn)行深入的研究。未來山羊凍精生產(chǎn)實(shí)踐中的突破點(diǎn)之一是：怎樣在不去除精漿的情況下進(jìn)行山羊精液冷凍保存，同時使復(fù)蘇后精子活力和受精能力達(dá)到一個較高的水平。

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