熒光定量PCR技術(shù)用于食品肉類種源摻假鑒定

在國內(nèi)及國際貿(mào)易中，我國肉制品摻雜、以次充好的欺騙行為屢見不鮮，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益，并且對我國出口肉制品在國際市場上的聲譽(yù)造成損害。要杜絕這些摻雜使假的現(xiàn)象，關(guān)鍵手段是要建立一種能快速準(zhǔn)確鑒別動物種源成分的檢測方法，為上述產(chǎn)品的質(zhì)量做本質(zhì)上的把關(guān)，提高執(zhí)法的科學(xué)性和高效性，進(jìn)一步提高檢驗(yàn)檢疫通關(guān)速度。因此，建立一種快速、靈敏、特異的檢測肉類種源的檢測方法一直是有待解決的難題。

目前，動物源性成分鑒別的主要方法有物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法。

物理學(xué)鑒別方法常用鏡檢法，通過觀察來區(qū)分禽類、哺乳動物和魚類，但該方法本身卻并不能區(qū)分動物的種類。在檢測的過程中，需要有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)員進(jìn)行操作，可以定量檢測0.1%以下的骨片段。

化學(xué)方法進(jìn)行動物源性分析主要有色譜法和光譜法兩種，但是化學(xué)方法的樣品制備比較復(fù)雜，檢測儀器相對較貴，無法分析高度處理過的樣品。

免疫學(xué)方法以檢測蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)，主要有同工酶檢測、酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）以及電泳方法等，但其由于缺乏較高重現(xiàn)性和靈敏度以及受樣品性質(zhì)影響而受到限制。免疫學(xué)鑒別方法主要用于鑒別粗加工肉類的動物種類，只有少數(shù)的方法可以用于檢測蒸煮肉類的蛋白質(zhì)，因此很多的免疫學(xué)鑒別方法都不能用于熱處理肉品。

分子生物學(xué)方法主要有常規(guī)PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR等，同時(shí)DNA雜交技術(shù)、PCR-電泳、PCR-限制性片段長度多態(tài)分析技術(shù)、隨機(jī)引物的擴(kuò)增法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、DNA基因檢測手段式PCR技術(shù)等也是目前發(fā)展較為領(lǐng)先的幾種分子生物學(xué)方法。

熒光定量PCR通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。本方法檢測原理主要利用一對動物線粒體基因保守區(qū)域特異性引物，配以FQ-Buffer、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）-熒光法進(jìn)行體外擴(kuò)增，從而達(dá)到快速檢測的目的。

基于熒光定量分析技術(shù)，根據(jù)常見動物如豬、驢、牛、羊的DNA序列，設(shè)計(jì)并最后確定了特異引物，建立了熒光定量PCR檢測方法，可以用于豬、驢、牛、羊肉及肉制品的種源成分快速鑒定檢測分析，具有高效、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可進(jìn)行批量樣本快速檢測。方法主要用于檢測動物組織、血液以及食品、肉類制品、飼料中有動物種源性特定成份鑒定，是適用于政府檢測機(jī)構(gòu)、食品加工企業(yè)、進(jìn)出口貿(mào)易企業(yè)的優(yōu)秀的檢測分析方法。并且檢測結(jié)果能夠達(dá)到與國家要求的行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)相一致，與歐盟、美國FDA檢測標(biāo)準(zhǔn)相符合。

熒光定量PCR技術(shù)用于食品肉類種源檢測方法建立

1 檢測原理

本檢測方法用一對線粒體基因保守區(qū)域特異性引物，配以FQ-Buffer、耐熱DNA聚合酶（Taq 酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）-熒光法進(jìn)行體外擴(kuò)增，從而達(dá)到快速檢測的目的，實(shí)現(xiàn)對動物組織、血液以及食品、肉類制品、飼料中動物源性成分的定性、定量分析。

2 熒光定量PCR檢測方法建立

對豬、驢、牛、羊等動物源樣品進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)而對引物和探針設(shè)計(jì)、合成及使用，經(jīng)過對動物源樣品進(jìn)行DNA提取與測定，構(gòu)建熒光定量PCR反應(yīng)體系，并在熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，通過對反應(yīng)體系、檢測手段的不斷優(yōu)化，最終形成完善的熒光定量PCR檢測方法。

3 熒光定量PCR檢測方法驗(yàn)證

以驢源檢測方法為例，進(jìn)行熒光定量PCR檢測方法驗(yàn)證。將動物組織經(jīng)過勻漿、離心等預(yù)處理，進(jìn)行DNA提取。應(yīng)用熒光定量PCR快速檢測方法對動物組織中驢源成分進(jìn)行檢測。取出驢-qPCR MIX、Taq酶系，配制測試反應(yīng)體系。向每管中加入處理后樣品或驢-陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，并將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性控品，陽性質(zhì)控品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置樣品名稱和循環(huán)條件，進(jìn)行梯度循環(huán)反應(yīng)，并對方法的特異性、靈敏性進(jìn)行驗(yàn)證。反應(yīng)結(jié)束后，判斷反應(yīng)結(jié)果。

檢測結(jié)果表明，本研究建立的熒光定量PCR方法具有良好的特異性，與國標(biāo)方法的檢測結(jié)果符合率為100%，未出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。

用試劑盒分別檢測不同濃度驢肉組織的樣品，分別為：約1/2檢測限濃度（0.05%）樣品10個(gè)、檢測限濃度（0.1%）樣品10個(gè)和2倍高于檢測限濃度（0.2%）樣品10個(gè)測定（見表1）。

檢測結(jié)果：1/2檢測限濃度（0.05%）樣品的陽性率為40%（4/10）；檢測限濃度（0.1%）樣品的陽性率為100%（10/10）；2倍檢測限濃度（0.2%）樣品的陽性率為100%（10/10）。結(jié)果表明，該試劑盒對驢源性成分的檢測限能達(dá)到的0.1%。

利用本方法檢測陰性樣品20份，包括豬肉、羊肉、牛肉、驢肉樣本各5份，對出現(xiàn)陽性結(jié)果的樣本重復(fù)檢測一次，通過陰陽性來判斷試劑盒的特異性。檢測結(jié)果表明，該方法對豬肉、羊肉、牛肉、驢肉源性成分的檢測假陽率為0。

同時(shí)，檢測含量等于或大于檢測限的豬肉、羊肉、牛肉、驢肉樣品30份，計(jì)算出假陰性率。對可疑陰性樣本重復(fù)檢測一次，統(tǒng)計(jì)假陰性數(shù)，計(jì)算假陰性率。按照下列公式計(jì)算假陰性率：假陰性率=假陰性數(shù)/30×100%，結(jié)果顯示該方法對豬肉、羊肉、牛肉、驢肉源性成分的檢測假陰性率為0。

此外，通過建立20多種動物樣本的物種資源庫（包括：大鼠、小鼠、豚鼠、貓、雞、鴨、鵝、鵪鶉、牦牛、馬、狐貍、貂、貉、兔、貓、豬、羊、驢、鹿等），利用熒光定量PCR檢測方法進(jìn)行物種間鑒定識別，結(jié)果顯示，本方法能夠有效識別樣本物種來源，種屬間特異性檢測結(jié)果表現(xiàn)良好。

4 方法對比

通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可得，熒光定量PCR技術(shù)檢測動物性食品中驢源性成分具有較高的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，通過熒光信號的檢測可以直接對產(chǎn)物進(jìn)行定量。相比較于傳統(tǒng)的檢測方法，熒光定量 PCR檢測方法具有高通量和低成本的優(yōu)勢，具有廣闊的應(yīng)用前景。

維德維康保障食品種源安全

北京維德維康生物技術(shù)有限公司是一家專業(yè)從事食品安全檢測、獸藥殘留快速檢測技術(shù)、動物疫病快速診斷技術(shù)研究及產(chǎn)品開發(fā)的高新技術(shù)企業(yè)，在獸藥、非法添加劑、毒素、細(xì)菌蛋白等化合物的抗原和抗體制備方面具有豐富的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。公司堅(jiān)持自主創(chuàng)新，現(xiàn)已建成了針對小分子化合物的抗體資源庫，庫容量近千種，整合自身的工藝優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品的高效產(chǎn)業(yè)化，迅速推出了當(dāng)前市場緊缺的檢測產(chǎn)品，為食品安全檢測市場提供了更多更優(yōu)的選擇。

目前，北京維德維康生物技術(shù)有限公司已取得完備的熒光定量PCR技術(shù)成果：提取制備了相應(yīng)的豬、驢、牛、羊源DNA模版，設(shè)計(jì)并合成出匹配的引物、探針，形成了完善的熒光定量PCR檢測方法，并對其特異性、穩(wěn)定性、靈敏性等指標(biāo)進(jìn)行了檢驗(yàn)，為國內(nèi)肉及肉制品行業(yè)食品安全保駕護(hù)航。