山核桃干腐病拮抗細(xì)菌的鑒定及其抑菌效果1)

葛康康 姚翰文 潘佳亮 郝昕 馬玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150001)

山核桃(Caryacathayensis)是胡桃科(Juglandaceae)山核桃屬(Carya)的一種干果樹種，落葉喬木[1],具有很高的經(jīng)濟(jì)價值和廣闊的發(fā)展前景[2]。山核桃干腐病是近幾年才出現(xiàn)的重要病害，不但影響山核桃的果實產(chǎn)量，而且會削弱樹勢，嚴(yán)重時甚至?xí)?dǎo)致樹木過早死亡，并造成重大經(jīng)濟(jì)損失，該病在浙江臨安、淳安、桐廬一帶發(fā)生比較普遍，植株發(fā)病率達(dá)80%～100%，最嚴(yán)重的造成全株或枝干干枯死亡[3]。2011年首次報道山核桃干腐病病原菌為Botryosphaeriadothidea，屬于子囊菌門葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)的葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)[4]。目前對山核桃干腐病的防治主要停留在物理防治和化學(xué)防治階段。章順來的研究表明，山核桃干腐病病部病斑少時，一般采取刮除病部后涂藥；病斑多時，病部劃傷后噴80% 402抗菌劑200倍液的方法進(jìn)行防治[5]。張傳清等報道V(戊唑醇)∶和V(腐霉利)=1∶5復(fù)配后對山核桃干腐病具有協(xié)同增效作用[6]?；瘜W(xué)藥劑的使用不僅會破壞生態(tài)環(huán)境,而且影響果實品質(zhì),甚至可能造成食品安全問題。為了能夠解決以上問題,尋找能夠高效防治山核桃干腐病的低毒或無毒生防制劑勢在必行。

生物防治具有無毒、無殘留和無污染等特點(diǎn)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種嗜熱的好氧革蘭氏陽性菌[7-8]，能夠抑制多種根部病害、枝干病害、葉花部病害的病原菌[9],是一種理想的生防微生物。范青等用從北京蘋果園土壤中分離的枯草芽孢桿菌B-912防治柑桔青霉病、綠霉病均取得較好的抑制效果[10]，何紅等[11]發(fā)現(xiàn)來自辣椒體內(nèi)的枯草芽孢桿菌菌株對香蕉炭疽病菌菌絲生長、分生孢子形成及萌發(fā)等有較強(qiáng)的抑制作用，林東等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對水稻白葉枯病菌具有強(qiáng)烈的抑菌作用[12]。本研究在山核桃干腐病病原菌的培養(yǎng)過程中分離到1株具有抑菌活性的生防菌，并對其進(jìn)行了分離純化、抑菌活性測定和鑒定等方面的研究,以期為山核桃干腐病的生物防治提供參考。

1 材料

1.1 供試菌株

山核桃干腐病病原菌來自浙江林業(yè)科技大學(xué)病理組病理實驗室，枯草芽孢桿菌菌株BS111分離自環(huán)境中，二者均保存在東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(LB)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH=7.4～7.6,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL，pH=7.4～7.6,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

2 研究方法

2.1 拮抗菌BS111的分離純化

在培養(yǎng)核桃干腐病菌的過程中，分離到1株對核桃干腐病菌有明顯抑制作用的拮抗細(xì)菌，采用劃線法用接種環(huán)挑取單菌落將其在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)24 h后，對菌落大小、色澤、表面光滑度及邊緣形狀等進(jìn)行觀察,并挑取單菌落進(jìn)行純化[13]，命名為BS111，將純化后的菌種在冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 拮抗菌BS111的鑒定

采用CTAB法提取DNA，PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后將未純化產(chǎn)物送往北京生物工程科技有限公司進(jìn)行測序。測序引物為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。根據(jù)16 S rDNA的測序結(jié)果，在NCBI上應(yīng)用BLAST進(jìn)行序列比對，結(jié)合GenBank中芽孢桿菌屬中的15個種的16 S rDNA，利用MEGA5.1軟件和ClustalW軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]《微生物學(xué)實驗手冊》[15]進(jìn)行鑒定，分別進(jìn)行接觸酶、V-P測定、厭氧生長、糖發(fā)酵產(chǎn)酸、醇發(fā)酵產(chǎn)酸、水解淀粉、檸檬酸鹽利用、苯丙氨酸脫氫酶、硝酸鹽還原、吲哚實驗、酪素水解、7% NaCl耐受度、pH=5.7耐受度、高溫65 ℃耐受度等生理生化鑒定。將生防菌在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行芽孢染色和鞭毛染色。

2.3 拮抗菌BS111的抑菌活性測定

采用平板對峙法進(jìn)行拮抗菌的抑菌活性測定[16]。用打孔器(Φ=4 mm)在培養(yǎng)3 d的山核桃干腐病病原菌菌落邊緣打取菌餅，接于PDA平板中央，在其四周距培養(yǎng)皿邊緣25 mm處接種拮抗菌，以不接拮抗菌為對照，于恒溫箱中25 ℃培養(yǎng),每個處理3個重復(fù)。測量抑菌圈直徑。

2.4 不同發(fā)酵時間拮抗菌BS111發(fā)酵液抑菌活性的測定

挑取拮抗菌BS111單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min，25 ℃搖床振蕩培養(yǎng)；每隔2 h取一次樣，測生長曲線(OD600)。取發(fā)酵液4 ℃、8 000 r/min、離心30 min，取上清液過0.22 μm濾膜，制成無菌濾液，每隔12 h取一次樣，測無菌濾液對山核桃干腐病病原菌抑菌活性；比較生長曲線和抑菌活性隨時間變化的關(guān)系，以及抑菌活性物質(zhì)積累的最佳培養(yǎng)時間，以未接菌的培養(yǎng)液為對照。

抑菌率=(對照組菌絲直徑-試驗組菌絲直徑)/(對照組菌絲直徑-0.4)×100%。

2.5 不同體積分?jǐn)?shù)拮抗菌BS111發(fā)酵液抑菌活性的測定

取搖床培養(yǎng)72 h的無菌濾液溶于50 ℃ PDA，制成體積分?jǐn)?shù)為15.00%、10.00%、7.50%、5.00%、2.50%、1.25%的帶藥平板，用打孔器(Φ=4 mm)在培養(yǎng)3 d的山核桃干腐病病原菌菌落邊緣打取菌餅,接于帶藥平板中央,3 d后測菌絲直徑，并計算抑菌率，每組3次重復(fù)。

2.6 拮抗菌BS111發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性的測定

熱處理對發(fā)酵液抑菌活性的影響：取相同體積的6份發(fā)酵上清液通過0、10、20、30、40、50 ℃水浴鍋處理30 min，以未處理的無菌濾液為對照，過0.22 μm濾膜，測抑菌活性。

酸堿處理對發(fā)酵液抑菌活性的影響：取相同體積的7份發(fā)酵上清液，分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液，pH值為3.0、4.5、5.5、6.5、7.5、8.0、9.0，靜置2 h后，再用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)到pH為7.0，以未處理的無菌濾液為對照，過0.22 μm濾膜，測抑菌活性。

紫外線處理對發(fā)酵液抑菌活性的影響：取相同體積的4份發(fā)酵上清液分別放在紫外光下照射15、30、60、120 min，以未處理的無菌濾液為對照，過0.22 μm濾膜，測抑菌活性。

2.7 拮抗菌無菌濾液對山核桃干腐病病原菌菌絲生長的影響

在培養(yǎng)3 d的山核桃干腐病病原菌菌落邊緣打取菌餅,接于帶有無菌濾液的PDA帶藥平板中央,以未接菌的培養(yǎng)液為對照,3 d后挑取菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。

3 結(jié)果與分析

3.1 拮抗菌BS111培養(yǎng)性狀

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的菌株(圖1)，菌落為白色橢圓形，邊緣整齊，中間凹陷有褶皺，表面比較粗糙，不透明，在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d有菌膜產(chǎn)生，革蘭氏染色為陽性。

圖1 拮抗細(xì)菌BS111的培養(yǎng)性狀

3.2 拮抗菌BS111 16 S rDNA分子鑒定

菌株BS111的16 S rDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1條約為1.5 kb的特征帶(圖2)，將PCR后的片段送交北京生物工程進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，該菌株16 S rDNA序列全長為1 129 bp，該序列通過NCBI(http:

www.ncbi.nlin.nili.gov)進(jìn)行BLAST比對，其中，BS111與JQ308575Bacillussubtilis的同源性最高，達(dá)到99%。

M.2 kb Mark；B.BS111菌株。

將得到的菌株BS111序列與Genbank中的枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)、死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)等菌株的16 S rDNA序列進(jìn)行比對。從圖3的系統(tǒng)發(fā)育樹可看出,不同的芽孢桿菌種間自然地形成不同的分支,BS111位于枯草芽孢桿菌的分支中，且與登錄號為JQ308575的枯草芽孢桿菌的序列相似性高達(dá)100%。

圖3 拮抗菌株BS111的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 拮抗菌BS111生理生化鑒定

對菌株BS111各項生理生化指標(biāo)的測定結(jié)果表明，接觸酶反應(yīng)為陽性，V-P測定呈陽性，能夠利用葡萄糖和甘露醇，并且產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣，厭氧條件下不能生長，能夠利用檸檬酸鹽，不能形成吲哚，苯丙氨酸脫氫酶反應(yīng)為陰性，能夠水解淀粉，在7% NaCl培養(yǎng)基上能夠生長，在65 ℃高溫條件下不能生長，在pH=5.7的酸性條件下不能生長。通過與枯草芽孢桿菌進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)BS111除不能在pH=5.7的酸性條件下生長外，其余都與枯草芽孢桿菌的生理生化指標(biāo)相同，故可以鑒定BS111為枯草芽孢桿菌。

3.4 拮抗菌株BS111對山核桃干腐病病原菌的抑制作用

通過平板對峙法可以看出，枯草芽孢桿菌BS111菌體能夠抑制山核桃干腐病病原菌的生長(圖4)。抑菌圈平均直徑為18 mm。

圖4 拮抗菌BS111對山核桃干腐病病原菌的抑制作用

3.5 拮抗菌BS111生長曲線及抑菌活性隨時間變化情況

對拮抗菌BS111生長曲線進(jìn)行測定，以檢測菌體生長狀況。結(jié)果如圖5所示，枯草芽孢桿菌BS111在12～24 h為對數(shù)期，24 h后菌體數(shù)量進(jìn)入穩(wěn)定期，36 h后菌體進(jìn)入衰亡期。對不同時間點(diǎn)的無菌濾液進(jìn)行抑菌能力測定，無菌濾液在前12 h抑菌率幾乎為0，此時無菌濾液對山核桃干腐病病原菌幾乎無抑制效果，在24 h時抑菌率迅速增長至70.65%，在24～60 h，抑菌率變化在70.65%～77.85%，變化差異不明顯，在60～72 h，抑菌效果有明顯提高，最高抑菌率為83.26%。此結(jié)果表明，無菌濾液在不同時間段內(nèi)抑菌差異顯著(P<0.05)。

圖5 拮抗菌株BS111生長曲線與無菌濾液抑菌率

3.6 拮抗株BS111發(fā)酵液抑菌活性及其穩(wěn)定性

對不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液抑菌活性的測定結(jié)果見圖6。隨著發(fā)酵液體積分?jǐn)?shù)的降低，抑菌率明顯降低，其中15%的抑菌效果最好，抑菌率為86.82%(表1)，該拮抗菌的EC50為4.16%，回歸方程為y=1.942x-1.203，相關(guān)系數(shù)為0.969。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)拮抗菌株BS111發(fā)酵液的抑菌活性

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

0、10、20、30、40、50 ℃水浴分別處理30 min后的BS111無菌濾液對山核桃干腐病的抑菌活性見表2。從表2可以看出，用不同溫度處理過的無菌濾液抑菌效果有明顯區(qū)別。0 ℃處理后發(fā)酵上清液對山核桃干腐病病原菌的抑菌效果最好，抑菌率為(62.29±0.13)%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對照組抑菌率(42.94±0.11)%，在0～20 ℃，抑菌率雖然有下降趨勢，但是都高于對照組，在30～50 ℃時，抑菌率和對照組差異不顯著。由此可以看出，該無菌濾液在0～20 ℃低溫條件下的抑菌效果比高溫條件下好，在30～50 ℃高溫條件下抑菌效果差異不明顯。

a.15%的發(fā)酵液；b.10%的發(fā)酵液；c.7.5%的發(fā)酵液；d.5%的發(fā)酵液；e.2.5%的發(fā)酵液；f.1.25%的發(fā)酵液；CK.對照組。

經(jīng)不同酸堿處理后的無菌濾液的抑菌活性有顯著變化。pH=3.0～5.5處理2 h后，抑菌率為(33.38±0.24)%～(36.59±0.28)%，明顯小于對照組抑菌率(40.49±0.35)%，經(jīng)pH=6.5～8.0處理2 h后抑菌率為40%～43%，與對照組差異不明顯，經(jīng)pH=9.0處理2 h后，抑菌率為(46.62±0.23)%，明顯大于對照組。由此可以看出，無菌濾液的抑菌活性隨著pH的升高，抑菌活性上升，且在pH=9.0時抑菌效果最好，無菌濾液在pH=6.5～8.0時抑菌活性穩(wěn)定。無菌濾液經(jīng)紫外處理后，抑菌率高于或接近對照組，并且隨著紫外處理時間的延長，抑菌效果有明顯提高，120 min時抑菌效果最好，抑菌率為(57.55±0.18)%。

表2 拮抗菌株BS111發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3.7 拮抗處理后山核桃干腐病病原菌菌絲生長的顯微觀察

對照組和處理組菌絲的顯微形態(tài)觀察結(jié)果表明,山核桃干腐病病原菌菌絲經(jīng)拮抗菌BS111無菌濾液處理后菌絲形態(tài)出現(xiàn)異常。對照組菌絲在生長過程中，菌絲細(xì)長，處理組菌絲表現(xiàn)出菌絲變粗，彎曲，有褶皺，部分原生質(zhì)體消失,菌絲頂端膨大變粗等特點(diǎn)(圖7)。

a、b.為正常生長的菌絲；c、d.為發(fā)酵液處理過的菌絲。

4 結(jié)論與討論

目前，對山核桃干腐病的防治主要采用化學(xué)藥劑，但化學(xué)藥劑在防治病害的同時也對當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，因此高效低毒的生防制劑產(chǎn)品成為山核桃生產(chǎn)發(fā)展的迫切需要[17]?？莶菅挎邨U菌是一種非常廣譜的拮抗細(xì)菌，侯琿等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對番茄莖基腐爛病菌和葡萄灰霉病菌具有抑制作用[18]，吳麗媛從土壤中分離出能夠抑制甜瓜細(xì)菌性果斑病的拮抗細(xì)菌枯草芽孢桿菌[19]，吳輝等從土壤中分離到1株具有高效拮抗辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)的生防菌Bs04[20]，本研究分離到的拮抗菌BS111對山核桃干腐病病原菌具有較好的抑菌效果，經(jīng)鑒定拮抗菌BS111為枯草芽孢桿菌。關(guān)于枯草芽孢桿菌防治山核桃干腐病病的研究在國內(nèi)尚鮮見相關(guān)報道，這為山核桃干腐病生防制劑開發(fā)提供了材料。

本研究通過對拮抗菌無菌濾液的抑制作用測定表明,拮抗菌無菌濾液能夠顯著抑制山核桃干腐病病原菌菌絲生長,且在發(fā)酵72 h時抑菌效果最好，這說明拮抗菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生能夠抑制山核桃干腐病病原菌菌絲生長的次生代謝產(chǎn)物,由此表明拮抗菌BS111在大量發(fā)酵后對山核桃干腐病的防治具有很好的應(yīng)用價值。本研究對拮抗菌BS111進(jìn)行了鑒定，并對其拮抗作用和抑菌活性進(jìn)行了研究,而對其發(fā)酵條件的優(yōu)化、抗菌活性物質(zhì)的提取鑒定及田間防效還有待于進(jìn)一步深入研究。

拮抗細(xì)菌在植物病害防治中起到非常重要的作用。林業(yè)上施用的生物抗生素或其他拮抗蛋白等和常規(guī)有機(jī)合成農(nóng)藥一樣，都要受到環(huán)境的影響[21]。在生物農(nóng)藥的活性成分分離、提純、濃縮等所有的生產(chǎn)加工過程中也都需要獲得其對光、熱等各種條件的穩(wěn)定性。本研究研究了其發(fā)酵產(chǎn)物在經(jīng)過紫外線、熱、酸堿等條件的處理后抗菌活性的變化，表明該拮抗菌具有很好的生防潛力。

吳輝等[20]通過光學(xué)顯微鏡觀察Bs04對辣椒疫霉菌絲形態(tài)的影響,發(fā)現(xiàn)菌絲分支增多、頂端畸形、原生質(zhì)濃縮及生長緩慢等現(xiàn)象。本試驗顯微觀察抑菌作用的結(jié)果為菌絲變粗、彎曲、有褶皺、部分原生質(zhì)體消失、菌絲頂端膨大變粗等特點(diǎn)，對于具體抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

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