細(xì)胞樣Western Blot分析技術(shù)探討

湯加勇，趙 華

Western Blot(蛋白印跡法)是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù),具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用方法,主要在分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫遺傳學(xué)等學(xué)科中時(shí)常用到。Western Blot是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色,并且通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況[1-2]。就分子生物學(xué)現(xiàn)狀來(lái)看,現(xiàn)代生物科學(xué)是生物科學(xué)與眾多學(xué)科之間相互交叉、滲透和相互促進(jìn)的結(jié)果。如分子生物學(xué)已滲入到分子發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、飼料學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)等學(xué)科。學(xué)科間的相互交叉是科學(xué)研究發(fā)展的必然趨勢(shì),特別是隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,其將帶動(dòng)整個(gè)生物科學(xué)的全面發(fā)展。

Western Blot分析技術(shù)作為分子生物學(xué)中一項(xiàng)定性和半定量檢測(cè)蛋白的常用技術(shù),其操作技術(shù)已經(jīng)很成熟[2-3],但是國(guó)內(nèi)很多實(shí)驗(yàn)室 (特別是非專業(yè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)由于分子生物學(xué)發(fā)展和起步晚、儀器設(shè)備條件限制、人員條件限制等因素,導(dǎo)致很難順利開展該分析技術(shù)。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所主要從事豬、禽、草食動(dòng)物和水生動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需要、營(yíng)養(yǎng)代謝與調(diào)控、飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定、飼料加工配制技術(shù)及交叉領(lǐng)域,如抗病營(yíng)養(yǎng)、分子營(yíng)養(yǎng)、營(yíng)養(yǎng)與微生態(tài)學(xué)等的研究,其在分子生物學(xué)方面的研究相對(duì)薄弱。因此,本實(shí)驗(yàn)專門通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)適合本實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞樣Western Blot分析技術(shù),在此與廣大同行進(jìn)行探討。

1 細(xì)胞蛋白樣品的制備

把培養(yǎng)好細(xì)胞的培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基去掉,用預(yù)冷的PBS緩沖液(pH＝7.2)洗滌細(xì)胞(按6孔培養(yǎng)板計(jì),PBS添加量為2 mL/孔,其余培養(yǎng)板按比例添加),輕輕搖動(dòng)10 s,然后棄去洗液。按以上操作再洗滌細(xì)胞一次,然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上(后面的操作均在冰上進(jìn)行),添加提前準(zhǔn)備好的RIPA細(xì)胞裂解液[4-6](按6孔培養(yǎng)板計(jì),裂解液添加量為每孔0.4 mL,其余培養(yǎng)板按比例添加),然后用槍頭反復(fù)吹吸裂解液,加快細(xì)胞的裂解。待細(xì)胞裂解完全后(約2 min左右),把裂解液全部移至1.5 mL離心管中,放置于冰上。為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及足夠的蛋白樣品量,常常需要把2個(gè)(甚至更多)培養(yǎng)孔的裂解液移至一個(gè)離心管中。待同一批樣品全部處理完后,再統(tǒng)一于4℃、13 000 rpm離心5 min,將上清液體按一管60μL轉(zhuǎn)移到PCR管中,-80℃保存,最多可保存2個(gè)月(建議一個(gè)月內(nèi)做完)。

2 上樣蛋白樣品的制備

將保存的蛋白樣品拿一管用bicinchoninic acid(BCA)法測(cè)定總蛋白的濃度[7],為保證測(cè)定的準(zhǔn)確性,同一樣品測(cè)定孔至少為6(n＝6),此處不能用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白濃度[8-10]。根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)每孔上樣總蛋白量不低于30μg[4-6],計(jì)算每個(gè)樣本的加樣體積,所有樣本的體積用1×RIPA裂解液來(lái)調(diào)節(jié)一致(1.5 mL離心管中),再加入蛋白loading buffer,沒有樣品的孔也要用1×RIPA裂解液和loading buffer按照相同的比例添加,混勻后放入沸水或100℃金屬浴中10 min(一定注意不能讓離心管管蓋爆開),然后迅速放置于冰上10 min。待冷卻后4℃、13 000 rpm離心10 min,小心吸取上清于PCR管中放置于冰上,準(zhǔn)備上樣、電泳。

3 SDS-PAGE電泳

凝膠的制備：根據(jù)目的蛋白的大小來(lái)選擇合適濃度的分離膠。目的蛋白小于20 kDa選擇12～15的分離膠；大于20 kDa選擇10的分離膠,濃縮膠一般固定為5[4-6]。Bio-Rad品牌的垂直凝膠電泳系統(tǒng)中,具體分離膠、濃縮膠的濃度及加樣體積如表1所示[11]。

電泳：待凝膠制備好后,取出凝膠放入電泳槽中,加入電極緩沖液,用加樣器緩慢加入相同體積的制備好的蛋白液 (1 mm厚玻板的每孔最大上樣量為30μL),加樣過(guò)程中一定要避免氣泡的產(chǎn)生,同時(shí)要在樣品旁加預(yù)染的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),沒有樣品的孔添加相同體積的1×RIPA裂解液和loading buffer混合液。加好樣品后,60 V電泳30 min,然后120 V電泳60 min或溴酚藍(lán)至玻板底部。

4 半干法轉(zhuǎn)膜

在SDS-PAGE電泳時(shí),將PVDF膜裁剪好,放入倒有甲醇的120 mm玻璃培養(yǎng)皿中先活化15 s,然后迅速轉(zhuǎn)移至1×轉(zhuǎn)膜液中,同時(shí)放入Bio-Rad的轉(zhuǎn)印濾紙一起浸泡至少15 min。待電泳完畢后,取出凝膠在1×電轉(zhuǎn)膜液中浸泡至少15 min。然后按濾紙—PVDF膜—SDS—PAGE膠—濾紙的順序放置好 (濾紙、PVDF膜和凝膠的大小要一致),15 V條件下根據(jù)目的蛋白大小電泳40～50 min(40 kDa左右蛋白一般電泳45 min)。

5 Western Blotting

轉(zhuǎn)膜完畢后,根據(jù)預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),用刀片切割目的蛋白條帶,放入孵育盒于5的BSA(5BSA用1×TBST溶解)、80 r/min進(jìn)行封閉至少1 h(一般2 h)。根據(jù)一抗效價(jià),按居中比例加入一抗孵育液 (用5的BSA稀釋),4℃孵育過(guò)夜。一抗的添加比例可根據(jù)目的蛋白的表達(dá)情況適當(dāng)調(diào)整,如有磷酸化的蛋白則應(yīng)先做。過(guò)夜后回收一抗孵育液 (一抗孵育液4℃放置可保存2周,至少可使用3次)[12],然后用1×TBST、80 r/min洗膜至少5 min,洗4次。根據(jù)二抗效價(jià),按居中比例加入二抗孵育液 (用 5的BSA稀釋),80 r/min、室溫孵育1～2 h(一般2 h)。回收二抗孵育液 (二抗孵育液4℃放置可保存2周,至少可使用3次),然后用1×TBST、80 r/min洗膜至少5 min,洗4次。HRP化學(xué)發(fā)光液按A液 ∶B液＝1∶1的比例加好,把洗凈的PVDF膜用衛(wèi)生紙去掉多余的洗膜液后放入發(fā)光液體、室溫、避光孵育2～3 min后用衛(wèi)生紙去掉多余的發(fā)光液[3],然后放入化學(xué)發(fā)光成像儀 (Bio-Rad)成像,根據(jù)條帶亮度的強(qiáng)弱調(diào)整曝光時(shí)間和圖片張數(shù)；通過(guò)成像軟件Image Lab(Bio-Rad)對(duì)圖片進(jìn)行相應(yīng)的處理,計(jì)算出相應(yīng)的蛋白表達(dá)量,即可對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[1-3]。

6 膜的洗滌和再次Blotting

用1×TBST對(duì)曝光過(guò)后的PVDF膜進(jìn)行洗滌(80 r/min至少5 min,至少洗4次)。洗完后加入stripping buffer、室溫、80 r/min放置至少2 h；然后用1×TBST對(duì)膜進(jìn)行洗滌 (80 r/min至少5 min,洗4次),最后將膜放置于1×TBST中4℃保存,準(zhǔn)備做下一次Blotting。

7 特別需要注意的問題

1)蛋白在反復(fù)凍融情況下極易降解,于是樣品裂解后一定要按照使用量對(duì)樣品進(jìn)行分裝保存,每次使用時(shí)取一管或多管,溶解后切勿放回冰箱再次使用；

2)一抗的選擇特別重要,現(xiàn)在市面上進(jìn)口抗體假貨較多,不管用國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口抗體如果使用多次后都做不出結(jié)果,那應(yīng)該考慮更換其他公司的抗體；

3)封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液盡量不要為了節(jié)省經(jīng)費(fèi)而使用脫脂奶粉,最好使用5的BSA；

4)PVDF膜一旦活化后就絕對(duì)不能讓其變干,否則會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)效果[13]。

8 各種試劑配方

1)RIPA裂解液的配制。

1 mL的 1×RIPA裂解液中含有 10μL的Protease inhibitor、 10 μL的 Phosphatase inhibitor 3、10μL的Na3VO4(濃度為100μmol/L)、10μL的PMSF(濃度為10 mg/mL),冰上放置,現(xiàn)用現(xiàn)配。

2)SDS-PAGE膠的配制。

SDS-PAGE膠的配制試劑及用量如表1所示。

表1 SDS-PAGE膠配方表

3)電極緩沖液的配制。

10×電極緩沖液為Trizma base 30.3 g、Glycine 144.0 g、SDS 10.0 g加dd H2O定容到1 L；使用時(shí)取10×電極緩沖液100 mL加水900 mL混勻、4℃保存即可。

4)轉(zhuǎn)膜液的配制。

10×轉(zhuǎn)膜液為 Trizma base 30.3 g、Glycine 144.0 g加dd H2O定容到1 L；1×轉(zhuǎn)膜液為10×轉(zhuǎn)膜液100 mL加700 mL的dd H2O加200 mL的甲醇,4℃保存。

5)1×TBST的配制。

10×TBS為 Tizma HCl 31.52 g、 NaCl 87.7 g加500 mL的dd H2O溶解后,調(diào)pH到7.4,然后定容到1 L； 1×TBST為100 mL的10×TBS加899 mL的dd H2O加 1 mL的 Tween 20混勻、4℃保存即可。

6)Stripping buffer的配制。

9 結(jié)束語(yǔ)

針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的具體情況,本文通過(guò)對(duì)細(xì)胞樣品Western Blot分析操作的每個(gè)步驟進(jìn)行摸索,專門建立了一個(gè)適合本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞樣Western Blot的分析技術(shù)規(guī)范。本操作步驟更注重細(xì)節(jié),比網(wǎng)上下載的普通步驟更詳細(xì),讓W(xué)B分析更容易。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (操作步驟和試劑配方)能很好地應(yīng)用于其他實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞樣品的WB分析。

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