食管鱗狀細(xì)胞癌中GFRα3蛋白的表達(dá)及臨床意義

陳雅琪，蹇順海，黃一凡，文 彬

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，95%的組織學(xué)類型為鱗狀細(xì)胞癌。GFRα3蛋白是膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子配體家族成員ARTN的特異性受體之一。GFRα3蛋白與ARTN特異性結(jié)合，能激活下游信號(hào)通路[1]。研究發(fā)現(xiàn)，GFRα3蛋白在胰腺癌及乳腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌的神經(jīng)侵襲[2]；與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及預(yù)后相關(guān)[3]。目前尚無GFRα3蛋白與食管鱗狀細(xì)胞癌病理特征相關(guān)的研究，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)GFRα3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，探討其與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料(1)收集2009年1月1日～2010年9月30日川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院存檔確診的食管鱗狀細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本114例，患者年齡39～82歲，平均(57.2±4.23)歲，另選取高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及原位癌標(biāo)本17例，年齡42～75歲，平均(59.6±6.37)歲；癌旁正常食管組織25例作對(duì)照，年齡49～78歲，平均(61.4±5.72)歲；所有標(biāo)本術(shù)前均未經(jīng)放、化療，術(shù)前簽署相關(guān)知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。 (2)收集2014年3月～2014年6月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科手術(shù)切除的新鮮食管腫瘤組織及距腫瘤大于5 cm的正常組織12對(duì)，年齡42～72歲，平均(59.4±5.12)歲，其中男性9例，女性3例，術(shù)后確診為食管鱗狀細(xì)胞癌；切除后置于冰上，生理鹽水沖洗后分裝于冷凍管，放于冷凍盒中于-80 ℃冰箱保存。所選樣本來源的患者術(shù)前均未經(jīng)放、化療，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1免疫組化 GFRα3蛋白兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Atlas公司(HPA020731稀釋濃度1 ∶600)，所選蠟塊冷凍后每個(gè)切片3 μm厚，以胰腺癌標(biāo)本做陽性對(duì)照，組織本身做陰性內(nèi)對(duì)照，免疫組化采用SP兩步法檢測(cè)GFRα3蛋白的表達(dá)。GFRα3蛋白陽性信號(hào)呈棕黃色顆粒，定位于鱗狀上皮細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果判定以GFRα3蛋白陽性染色范圍及著色強(qiáng)度共同確定，按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。按著色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者分?jǐn)?shù)相加為總積分，由兩位副高及以上級(jí)別病理醫(yī)師共同打分，最后取平均分，≤2分為陰性(-)，3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性()，6～7分為強(qiáng)陽性()。

1.2.2Western blot檢測(cè) 蛋白提取，BCA蛋白濃度測(cè)定，凝膠配置試劑盒、上樣緩沖液、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、PVDF膜、超敏ECL發(fā)光液購(gòu)于碧云天公司。具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，取食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織各100 mg，加入液氮研磨成粉，按100 mg加入裂解液400 μL，充分混勻，冰上裂解，低溫離心，取上清液分裝，上清液按4 ∶1加電泳緩沖液于PCR儀上99 ℃變性15 min，與配置好的凝膠上樣電泳，濃縮膠80 V至分離膠時(shí)，改為120 V電泳至分離膠底部，剪裁與膠相適大小PVDF膜，甲醇中活化15 s，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉3 h；4 ℃冰箱內(nèi)一抗(GFRα3蛋白濃度1 ∶250，GAPDH濃度1 ∶2 000)過夜，次日常溫二抗(1 ∶5 000)60 min，ECL發(fā)光，圖像采集。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier曲線，用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)圖表示。

2 結(jié)果

2.1不同食管組織中GFRα3蛋白的表達(dá)GFRα3蛋白主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色。GFRα3蛋白在25例正常食管黏膜上皮中不表達(dá)，在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及原位癌組織和食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率分別為29.4%、76.3%。其在癌組織的陽性率明顯高于高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及原位癌組織、正常食管黏膜上皮，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1，圖1)。

ABCD

圖1A.GFRα3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中呈()，SP兩步法；B.GFRα3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中呈()，SP兩步法；C. GFRα3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中呈(+)，SP兩步法；D. GFRα3蛋白在原位癌組織中呈(+)，SP兩步法

表1 不同食管組織中GFRα3蛋白的表達(dá)

N為正常組織；H+S為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及原位癌組織；ESCC為食管鱗狀細(xì)胞癌組織；△與H+S比較，P<0.05；○與ESCC比較，P<0.01；◇與N比較，P<0.01

2.2GFRα3蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系114例食管鱗狀細(xì)胞癌中，男性89例，女性25例；年齡39～82歲，中位年齡57歲。統(tǒng)計(jì)GFRα3蛋白與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系，GFRα3蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)深度、TNM分期有關(guān)(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 GFRα3蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3Westernblot檢測(cè)GFRα3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)術(shù)中搜集并經(jīng)術(shù)后病理確診的食管鱗狀細(xì)胞癌組織12例，以距離其大于5 cm的癌旁組織為對(duì)照。Western blot檢測(cè)并以相對(duì)分子質(zhì)量3.6×104的GAPDH作內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量以GFRα3蛋白與GAPDH灰度值比值表示，觀察GFRα3蛋白在兩組中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFRα3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和正常組織中均有不同程度的表達(dá)，且在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及正常組織中GFRα3蛋白的表達(dá)

2.4生存分析評(píng)價(jià)GFRα3蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過電話對(duì)患者進(jìn)行回訪，以手術(shù)出院之日開始隨訪，隨訪60個(gè)月共獲得39例資料。其中18例存活，總生存率46.2%。13例GFRα3蛋白陽性生存率為23.1%(3/13)，26例陰性組生存率57.7%(15/26)，GFRα3蛋白陽性組生存率明顯低于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中GFRα3蛋白表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

3 討論

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，類型以鱗狀細(xì)胞癌為主，我國(guó)是食管癌的高發(fā)地區(qū)，2012年新發(fā)病例和死亡病例達(dá)22.3萬和19.7萬，約占全球發(fā)病和死亡人數(shù)的一半，5年生存率約20%[4]；在川東北地區(qū)食管癌發(fā)病率位居第一位[5]。食管癌患者早期臨床癥狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)，有癥狀者入院時(shí)檢查發(fā)現(xiàn)大多已為中晚期，是造成患者死亡的重要因素。因此，尋找新的早期診斷方法至關(guān)重要。GFRα3蛋白為糖基化磷脂酰肌醇細(xì)胞膜表面受體，是膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體家族成員之一，位于染色體5q31.2，編碼400個(gè)氨基酸[6]，與其上游神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子配基ARTN及下游的定位于細(xì)胞膜上的因子RET形成復(fù)合物，向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)[7]，除維持機(jī)體神經(jīng)元存活外，也與惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)[8]，但GFRα3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用尚不明確，本實(shí)驗(yàn)分析GFRα3蛋白在食管癌前病變及食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，腫瘤發(fā)生是逐步演化的過程，從正常組織到高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及原位癌組織，GFRα3蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，腫瘤發(fā)展到鱗狀細(xì)胞癌GFRα3蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.01)，Western blot實(shí)驗(yàn)也證實(shí)GFRα3蛋白在鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)高于正常組織(P<0.01)，隨著疾病發(fā)展，GFRα3蛋白表達(dá)逐級(jí)升高，臨床上可通過檢測(cè)GFRα3蛋白表達(dá)水平來預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)，GFRα3蛋白表達(dá)水平與患者腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床分期及預(yù)后相關(guān)，浸潤(rùn)越深，GFRα3蛋白表達(dá)越高；臨床分期越晚，GFRα3蛋白表達(dá)越高，術(shù)后生存率越低。提示在食管鱗狀細(xì)胞癌臨床進(jìn)展中，GFRα3蛋白也起重要作用。其作用機(jī)制不明，可能與其上游配基因子ARTN一樣，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及生存期來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，并促進(jìn)上皮到間充質(zhì)的轉(zhuǎn)變及血管生成加強(qiáng)癌癥干細(xì)胞的生物行為，進(jìn)而表現(xiàn)為腫瘤的生物學(xué)行為[9-10]。另查閱文獻(xiàn)GFRα3蛋白能在其他惡性腫瘤中表達(dá)，Wu等[3]應(yīng)用免疫組化及原位雜交法分析GFRα3蛋白及mRNA在乳腺良性病變及乳腺癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GFRα3蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯升高，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、HER-2表達(dá)及預(yù)后相關(guān)；朱棟良等[2]研究 GFRα3蛋白的表達(dá)與胰腺癌生物學(xué)關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFRα3蛋白與胰腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及神經(jīng)侵襲相關(guān)。

以上研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)大致相符，但是在食管鱗狀細(xì)胞癌中，GFRα3蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，這與以上兩種惡性腫瘤不符，推測(cè)原因：(1)GFRα3蛋白是一個(gè)與神經(jīng)侵襲相關(guān)因子配基受體，可能本實(shí)驗(yàn)選取樣本神經(jīng)侵襲與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是兩個(gè)獨(dú)立的過程，兩者之間無明顯影響，與繆錦峰等[11]的觀點(diǎn)相符；(2)不同組織起源腫瘤之間發(fā)病機(jī)制本身存在差異，GFRα3蛋白是否與食管鱗狀細(xì)胞癌神經(jīng)侵襲有關(guān)，對(duì)食管癌擴(kuò)散方式的認(rèn)識(shí)、治療方法的選擇意義重大。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明GFRα3蛋白在食管癌前病變到食管鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展過程中表達(dá)逐漸升高，且與患者臨床分期及預(yù)后相關(guān)，推測(cè)GFRα3蛋白參與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展，有望成為患者臨床分期及預(yù)后的新生物學(xué)指標(biāo)。

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