非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織多驅(qū)動(dòng)基因聯(lián)合檢測(cè)及其臨床意義

楊長紹，楊延龍，丁曉潔，杜亞茜，李 權(quán)，郭銀金，劉俊熙，周永春

近年肺癌在我國發(fā)病率逐年增加，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)最為常見，占肺癌的80%～85%。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，NSCLC靶向治療備受關(guān)注，選擇合適的患者進(jìn)行靶向治療是其成功的關(guān)鍵。目前，NSCLC患者僅局限于少量突變位點(diǎn)的檢測(cè)，有相當(dāng)部分患者因未能及時(shí)檢測(cè)相關(guān)突變而錯(cuò)失最佳治療方案，延誤治療時(shí)機(jī)。因此，通過多基因聯(lián)合檢測(cè)可加快有效篩選目標(biāo)人群，以實(shí)現(xiàn)在患者病程早期接受特異的針對(duì)性治療，減少毒副作用，提高治療效果。本文收集86例NSCLC患者行EGFR、ALK、ROS1及KRAS基因突變檢測(cè)，著重分析EGFR、ALK、ROS1及KRAS基因突變與患者性別、年齡、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、吸煙史等臨床病理特征的相關(guān)性，為臨床醫(yī)師合理選擇治療方案實(shí)施個(gè)體化治療提供有力的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料選取云南省腫瘤醫(yī)院2015年8月～2016年10月NSCLC手術(shù)標(biāo)本86例。所有腫瘤標(biāo)本均行10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片及HE染色，由年資較高的病理醫(yī)師復(fù)閱切片明確診斷，并確定有足夠的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。86例NSCLC患者中，男性42例，女性44例；患者年齡33～85歲，中位年齡55歲；腺癌71例，非腺癌15例；有淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移30例，未轉(zhuǎn)移56例；曾經(jīng)或正在吸煙者31例，無吸煙史者55例。

1.2DNA及RNA提取用二甲苯及75%乙醇擦拭刀片、切片機(jī)刀座、鑷子，保證無交叉污染，連續(xù)8 μm厚切片5～8張，按福爾馬林固定石蠟包埋樣品DNA/RNA共分離試劑盒(廈門艾德公司)提取基因組DNA及RNA，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。提取DNA保存在-20 ℃冰箱，RNA保存在-70 ℃冰箱備用。

1.3ARMS法人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)及人KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)均購于廈門艾德公司。根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)EGFR及KRAS基因突變。熒光定量PCR儀為StratageneMx3000P型。PCR反應(yīng)參數(shù)：第一階段：95 ℃ 5 min，循環(huán)1次；第二階段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個(gè)循環(huán)；第三階段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)；并在第三階段60 ℃時(shí)收集FAM和HEX信號(hào)。突變結(jié)果判斷根據(jù)試劑盒說明書判讀原則進(jìn)行。

1.4RT-PCR人ALK基因融合和ROS1基因融合聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)購于廈門艾德。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，取出反應(yīng)管，室溫解凍后，快速離心后置于冰架上，分別加入逆轉(zhuǎn)錄酶及待測(cè)樣品RNA。42 ℃保溫1 h，95 ℃保溫5 min后冰上冷卻，得到cDNA溶液用于PCR擴(kuò)增。取出已預(yù)分裝的八連管，在冰上融化后短暫離心，并按試劑盒說明書要求分別加入樣本cDNA、陰陽性對(duì)照，蓋緊管蓋，離心后置于熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s循環(huán)15次；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s循環(huán)31次。熒光信號(hào)收集時(shí)設(shè)定為FAM熒光信號(hào)，在60 ℃設(shè)置熒光信號(hào)收集。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析基因突變與患者性別、年齡、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無吸煙等臨床病理特征的相關(guān)性，χ2檢驗(yàn)或者確切概率法分析是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EGFR、KRAS、ALK及ROS1基因突變頻率與類型86例患者中，EGFR基因總突變率為47.7%(41/86)，其中EGFR基因Exon18 G719X(9.8%)、Exon19 del(36.6%)、Exon20 ins(2.4%)、Exon20 T790M(2.4%)、Exon21 L858R(29.3%)、Exon21 L861Q(4.9%)，6例患者(14.6%)出現(xiàn)雙突變，分別為3例(7.3%)Exon18 G719X與Exon21 L861Q雙突變，1例(2.4%)Exon18 G719X與Exon20 S768I雙突變，1例(2.4%)Exon21 L858R與Exon18 G719X雙突變，1例(2.4%)Exon21 L858R與Exon20 S768I雙突變(圖1)。KRAS基因總突變率為5.8%(5/86)，5例KRAS基因突變均為第12位密碼子的突變，分別為3例(60%)Gly12Cys，1例(20%)Gly12val及1例(20%)Gly12Cys、Gly12val雙突變；ALK基因融合率為8.1%(7/86)，其中1例患者存在Exon19 del與ALK融合共存，采用廈門艾德公司人EGFR/ALK/ROS1基因突變聯(lián)合檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果一致(圖2)；ROS1基因融合率為2.3%(2/86)。

2.2EGFR、KRAS、ALK及ROS1基因突變與NSCLC臨床病理特征相關(guān)性EGFR基因在腺癌患者中的突變率為54.9%(39/71)高于非腺癌患者(28.6%)，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)；女性患者的突變率為65.9%(29/44)高于男性患者(28.6%)，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；與患者年齡、是否吸煙、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)(P>0.05)。KRAS、ALK、ROS1基因與NSCLC臨床病理特征無明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。

圖1 NSCLC患者EGFR基因突變的分布情況(n=41)

圖2 EGFR基因外顯子19缺失突變(曲線M)，ALK基因重排(曲線R)，曲線PC為陽性對(duì)照，NC為陰性對(duì)照

3 討論

近年肺癌分子靶向治療的領(lǐng)域研究，主要集中在EGFR、ALK、ROS1及KRAS靶點(diǎn)上[1-4]。EGFR基因在43%～89%的NSCLC中表達(dá)上調(diào)，參與細(xì)胞的增殖、血管生成、抗凋亡和腫瘤侵襲，在腫瘤的形成以及介導(dǎo)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)揮重要作用，是目前NSCLC治療的重要靶點(diǎn)之一。EGFR作為治療NSCLC的分子靶標(biāo)受到普遍關(guān)注，吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、?？颂婺?icotinib)等EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-tyrosine kinaseinhibitor, EGFR-TKI)已廣泛應(yīng)用于臨床。位于EGFR下游的KRAS基因，其突變狀態(tài)與患者服用抗EGFR的靶向治療藥物療效密切相關(guān)，攜帶KRAS突變的癌癥患者對(duì)上述藥物的響應(yīng)率明顯下降[4]。ALK融合基因是NSCLC的驅(qū)動(dòng)基因，也屬于酪氨酸激酶，而克唑替尼是一種新開發(fā)的ALK酪氨酸激酶抑制劑，對(duì)ALK陽性NSCLC具有類似于EGFR-KTI的療效[5]?；谄淞己玫寞熜Ш湍褪苄裕?013年初CFDA已批準(zhǔn)克唑替尼用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性ALK陽性NSCLC患者。近年在NSCLC患者中還發(fā)現(xiàn)ROS1受體酪氨酸激酶染色體重排，ROS1是基因編碼胰島素受體家族中的受體酪氨酸激酶，該激酶與細(xì)胞生長、增殖等密切相關(guān)。2015年4月克唑替尼被FDA授予突破性藥物資格，用于ROS1陽性NSCLC的潛在治療，2016年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)臨床實(shí)踐指南中明確提出克唑替尼可用于ROS1融合的NSCLC治療[2]。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)NSCLC患者EGFR、KRAS、ALK及ROS1基因的突變狀態(tài)，有助于篩選適合EGFR-TKI及ALK抑制劑治療的人群。

表1 EGFR、KRAS、ALK及ROS1基因改變與NSCLC臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

*代表1例患者存在EGFR 19缺失突變與ALK融合共存

目前，EGFR及KRAS基因突變檢測(cè)的方法很多，包括直接測(cè)序法、ARMS、片段長度分析及變性高效液相色譜技術(shù)等[6]。直接測(cè)序法是最直接、可檢測(cè)已知和未知突變的方法，也是目前廣泛應(yīng)用的EGFR基因突變檢測(cè)法，但由于該方法靈敏度相對(duì)較低，對(duì)樣本量較少的標(biāo)本及穿刺、內(nèi)窺鏡活檢小標(biāo)本，不能敏感的檢測(cè)出突變。ARMS法檢測(cè)靈敏度比直接測(cè)序法高，檢測(cè)周期短，可對(duì)穿刺標(biāo)本及細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，且擴(kuò)增時(shí)閉管操作的特點(diǎn)，極大程度避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，易于在臨床樣品中檢測(cè)開展。ALK及ROS1融合基因的檢測(cè)方法主要有熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、免疫組化和RT-PCR等[7]。免疫組化法因其具有簡便易行、價(jià)格便宜、操作方法成熟等特點(diǎn)應(yīng)用較廣，但該方法靈敏度低，且不能明確融合基因型；FISH能特異和靈敏地檢出ALK融合基因，是目前檢測(cè)ALK融合基因的經(jīng)典方法，但價(jià)格昂貴，操作規(guī)范要求較高，檢測(cè)結(jié)果難以判讀、主觀性強(qiáng)等不足，在實(shí)際應(yīng)用上還存在一些限制；RT-PCR技術(shù)簡單快速準(zhǔn)確，可以明確融合基因型，適用于微量組織標(biāo)本，因而RT-PCR技術(shù)在篩選和確認(rèn)肺癌基因重組中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)采用ARMS及RT-PCR法檢測(cè)EGFR、KRAS、ALK和ROS1基因改變，取得較為滿意的效果。

86例NSCLC患者中，女性患者占51.2%(44/86)，EGFR基因突變率為65.9%(29/44)，顯著高于男性患者突變率28.6%(12/42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。腺癌患者占82.6%(71/86)，其EGFR基因突變率54.9%(39/71)顯著高于非腺癌患者13.3%(2/15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。吸煙患者占36.0%(31/86)，其EGFR基因突變率占41.9%(13/31)，非吸煙患者突變率50.9%(28/27)，吸煙與非吸煙患者差異無顯著性(P>0.05)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8]EGFR突變常見于女性、非吸煙、腺癌存在差異。在NSCLC治療中，EGFR基因是重要的生物學(xué)標(biāo)志物，其敏感突變最常見，與臨床療效最為相關(guān)的突變包括19外顯子缺失突變及21外顯子L858R突變，本組這兩類經(jīng)典突變約占所有EGFR突變的70.7%(29/41)；目前20外顯子的T790M突變的作用也比較明確，與EGFR-TKI原發(fā)及繼發(fā)耐藥相關(guān)，本組1例(1.2%)發(fā)生T790M突變；除上述突變外，EGFR基因其他位點(diǎn)突變，如G719X、L861Q、S768I等臨床突變率較低，常常傾向于以聯(lián)合突變的形式存在，本組有6例患者14.6%(6/41)存在雙突變，分別為3例(7.3%)G719X和L861Q雙突變，1例(2.4%)L858R和G719X雙突變，1例(2.4%)L858R和S768I雙突變，1例(2.4%)G719X和S768I雙突變。Chiu等[9]發(fā)現(xiàn)EGFR基因G719X、S768I聯(lián)合突變與單突變相比，EGFR雙突變可能對(duì)ATP親和力更強(qiáng)，對(duì)EGFR-TKI更敏感，因而EGFR-TKI治療具有較高的客觀緩解率及較長的無進(jìn)展生存期。

KRAS基因在NSCLC中突變比率15%～25%，中國人群突變比率約為7%，常見突變位于12、13、61密碼子突變，且近97%的KRAS基因突變涉及密碼子12及13。本實(shí)驗(yàn)86例NSCLC患者中KRAS基因突變率為5.8%(5/86)，分析發(fā)現(xiàn)5例KRAS基因患者均為第2外顯子中12密碼子的突變，與報(bào)道[10]一致。關(guān)于KRAS基因突變與臨床病理特征相關(guān)性，86例患者中KRAS基因在非吸煙患者突變率7.3%(4/55)高于吸煙患者3.2%(1/30)，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.441)，與Forbes等[10]報(bào)道KRAS基因突變與吸煙史密切相關(guān)，在非吸煙的患者中KRAS轉(zhuǎn)換突變(G→A)常見，而移位突變(G→T或G→C)在曾經(jīng)吸煙和正在吸煙的患者中不相符合；KRAS基因突變與其他臨床病理特征相關(guān)性，如患者性別、年齡、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)(P>0.05)，這與Riely等[11]報(bào)道一致。目前，對(duì)于KRAS基因突變NSCLC患者治療，大部分研究[4,10]顯示KRAS基因突變與肺癌患者對(duì)EGFR-TKI的原發(fā)耐藥有關(guān)，利用KRAS基因檢測(cè)可以為EGFR-TKI藥物治療患者的篩選提供重要參考。

EML4-ALK是在NSCLC中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的融合基因激酶抑制靶點(diǎn)，在肺腺癌中的發(fā)生率為6%～7%[12]。本實(shí)驗(yàn)中EML4-ALK發(fā)生率為8.1%(7/86)，其中1例患者存在EGFR 19缺失突變與ALK融合共存。在多數(shù)病例中，EML4-ALK融合與其他致癌基因(如EGFR或KRAS)突變不重疊[13]，但也有文獻(xiàn)[14]報(bào)道ALK和EGFR存在雙突變。Ren等[13]報(bào)道 EML4-ALK融合基因是NSCLC常見的臨床亞組，其典型的臨床特征包括：男性、年輕患者、非吸煙或少吸煙、腺癌或以腺癌細(xì)胞為主的病理類型。本組中ALK基因重排與患者性別、年齡、組織學(xué)類型、是否吸煙、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)(P>0.05)。

ROS1基因是NSCLC中的另一個(gè)融合基因激酶抑制靶點(diǎn)。Takeuchi等[15]報(bào)道腫瘤融合基因檢測(cè)顯示ROS1基因可以與TPM3、SDC4、EZR、LRIG3、SLC34A2和CD74融合形成多種ROS1重排亞型，ROS1融合在NSCLC患者中陽性率約2%，并被公認(rèn)為肺癌中致癌突變。本實(shí)驗(yàn)中ROS1基因融合發(fā)生率為2.3%(2/86)，與文獻(xiàn)報(bào)道接近。ROS1基因融合陽性與ALK重排陽性的NSCLC患者具有相似的臨床病理特征，即為年輕、非吸煙且為高度惡性趨勢(shì)的肺腺癌患者[16]，但本實(shí)驗(yàn)中ROS1基因融合與患者性別、年齡、組織學(xué)類型、是否吸煙、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)(P>0.05)，我們?cè)诤罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)中將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，NSCLC患者中EGFR基因突變和ALK融合基因均存在較高的突變率，KRAS、ROS1基因改變以及驅(qū)動(dòng)基因雙突變共存型基因突變率雖低，但不容忽視。2016年美國NCCN臨床實(shí)踐指南除了繼續(xù)推薦對(duì)于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的NSCLC患者進(jìn)行EGFR突變和EML4-ALK重排檢測(cè)外，更強(qiáng)調(diào)治療初期的多重基因檢測(cè)。通過多基因檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)在病程早期接受特異的針對(duì)性治療，減少毒副作用，提高治療效果，對(duì)臨床上加快有效篩選目標(biāo)人群有重要意義。

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