小鼠N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶-V在皮膚及肝細胞中的生理作用

張毓青，崔乃強

在細胞分化、致癌過程中可以觀察到糖基化的變化，被糖基轉移酶這樣的蛋白調控。每個寡糖的合成都需要糖基轉移酶，而這一酶是由特定的基因編碼的。這些基因構成了約1%的人類基因組。在糖工程的最新進展中，分子生物學已闡明寡糖的生物學功能[1]通常是復雜的分子相互作用的結果。即使在小鼠中敲除或過表達單糖基因，各種不同的糖蛋白也會改變其糖結構。當前的分子生物學技術手段不可能單獨改變單糖蛋白結構中特定的一種寡糖，因此，需要全面、有針對性的分析，了解生物每個低聚糖的具體功能。目前研究人員的注意力都集中在重要靶糖蛋白上，這些糖蛋白在特定的器官中是舉足輕重的角色。例如，表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）在皮膚細胞增殖的作用，和血管內(nèi)皮細胞轉化生長因子-β（vascular endothelial cell transforming growth factor-β,TGF-β）受體及其信號通路都是肝纖維化研究中的重點。N-乙酰葡糖胺轉移酶 -V（N-acetylglucosamine transferase-V,GnT-V），是一種糖基轉移酶，由Mgat5編碼的糖基轉移酶催化N-乙酰氨基葡萄糖的β1、6 N-聚糖支鏈而形成，被認為與癌癥生長和轉移相關[2-3]。1987年首次報道了GnT-V與癌癥轉移相關[4]，隨后，1993年Mgat5基因從大鼠[5]和人類中被克隆[6]。共有三個不同的信號通路被認為是由GnT-V介導且參與促進癌癥轉移。第一條信號通路涉及在β1-6GlcNAc和半乳糖凝集素-3上聚乳糖胺之間形成晶格，上調EGF-R信號，從而導致受體的胞吞作用被抑制[7]。第二條信號通路中，轉移酶-V通過添加β1-6GlcNAc分支結構，抑制蛋白酶降解，促進轉移[8]。第三個途徑包括抑制E-鈣粘蛋白/β-連環(huán)蛋白復合體的功能[9]。GnT-V基因敲除小鼠（Mgat5-/-小鼠）中誘導乳腺腫瘤生長和轉移的多瘤病毒中間型T癌基因顯著地降低，表明轉移酶-V對癌生長和轉移[10]是必不可少的。然而，臨床研究中的GnT-V的免疫組化研究已經(jīng)證實：GnT-V并不總是一個預后差的標記。雖然預后較差的結腸癌、乳腺癌和食道癌中表現(xiàn)出GnT-Ⅴ的高表達，相反在肺癌、甲狀腺癌及肝癌中觀察到低表達。這種差異可能是由于不同的腫瘤中GnT-V不同的靶蛋白造成的。然而，作為預后標志物，在幾乎所有癌癥的早期階段，GnT-V的表達量均升高。因此， EGF-R信號的上調和蛋白酶的活化是癌變的早期事件。所以，使用β-肌動蛋白啟動子建立GnT-V轉基因小鼠（GnT-V Tg小鼠），可能確定哪些器官將患癌癥。但是出人意料的是，在GnT-V的轉基因小鼠中沒有觀察到的任何器官的自發(fā)的癌癥。不過，該鼠展示了GnT-V在皮膚和肝細胞中的生理作用，以及這些組織的中對刺激物的影響。

1 GnT-V轉基因小鼠中上皮-間質轉化（epithelialinterstitial transformation，EMT）表型的觀察

EMT特點是上皮丟失和間充質特性的獲得，在生物進程中起著根本性的作用，如傷口愈合、胚胎發(fā)展以及癌細胞的侵襲和轉移[11]。在成人中，EMT通過細胞因子的釋放對組織損傷做出回應，介導了成纖維細胞在炎癥和傷口愈合中的產(chǎn)生[12-13]。在傷口愈合中再上皮化涉及上皮細胞的運動或遷移，在傷口邊緣移動的上皮細胞獲得間充質特性，經(jīng)歷EMT的早期階段遷移[12]。先前Demetriou等[14]通過體外研究證實，在貂肺上皮細胞(Mv1Lu)細胞過表達GnT-Ⅴ增強了這些細胞在劃痕實驗中的遷移，表明的GnT-V對EMT的作用。有一篇關于GnT-Ⅴ Tg小鼠皮膚EMT樣表型的報道[15]。GnT-ⅤTg小鼠的皮膚通過用膠紙反復去除角質層后局部更容易被損壞，這表明細胞-細胞的黏附在這些小鼠中是極易被損害的。正如預期的那樣，E-cadherin，最重要的一個細胞黏附分子的表達，在GnT-ⅤTg小鼠分離出來的膠質細胞中顯著地降低。相反，間充質蛋白質如N-鈣粘蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的表達增加。另外，從GnT-ⅤTg小鼠分離出的角質細胞的遷移顯著增強。這些改變主要是由于EMT調節(jié)轉錄因子，如捻蛋白（twist）和蝸牛蛋白（snail）的表達增加有關，twist和snail的表達增加是通過活化通常引起EGF或TGF-β受體介導的信號傳導途徑誘導的。

有報道稱，在腫瘤細胞中加入β1-6GlcNAc支鏈到這些受體能抑制細胞內(nèi)吞作用，并延長這些分子的信號[7]。GnT-V Tg小鼠角化細胞中的EGF-R的信號增強，表明在正常的角質形成細胞中有相似的糖信號發(fā)生。為了在體內(nèi)評價EMT的表型和增強GnT-V Tg鼠角質細胞的遷移，科學家們進行了皮膚傷口愈合實驗，在GnT-V Tg小鼠和對照組小鼠背部制作8 mm的圓形傷口。第4 d，GnT-V Tg轉基因小鼠傷口面積比對照組顯著小。值得注意的是，GnT-V Tg轉基因小鼠的再上皮化速度更快。總之，在GnT-V Tg小鼠皮膚上觀察到的GnT-V促進EMT和促進角質細胞活力和皮膚傷口愈合的功能可能部分地由EGF受體介導的信號通路調控。

2 GnT-V通過EGF-R信號通路調節(jié)角質細胞的形成維持皮膚的穩(wěn)態(tài)

在炎癥和細胞增殖中GnT-V的表達增加[16-17]。通過上調GnT-Ⅴ給它們的受體增加β1,6GlcNAc支鏈，增加生長因子和/或細胞因子的表達。EGF-R介導的信號通路在維持皮膚穩(wěn)態(tài)中也起著重要的作用。成熟健康的表皮細胞的增殖是通過平衡EGF家族的不同成員的信號來實現(xiàn)的，如肝素結合表皮生長因子（heparin binding epidermal growth factor,HB-EGF）、TGF-α、雙調蛋白，這些均在表皮中與EGF-R結合[18-19]。

盡管GnT-V Tg小鼠中皮膚比其他器官GnT-V蛋白的表達高，但GnT-Ⅴ Tg小鼠或正常條件下的GnT-V缺陷的皮膚中無組織學變化[15]。但是，轉移酶-V缺陷小鼠在佛波酯-三苯基甲酸(TPA)處理后表皮異常的增生減少[20]。TPA誘導生產(chǎn)HB-EGF，在角質形成細胞的增殖中起著重要的作用。HB-EGF的產(chǎn)生為膜-錨定形式，然后被細胞表面蛋白酶切割。TPA刺激這些蛋白酶的激活，導致可溶性的HB-EGF的水平增加。GnT-V缺陷的小鼠中TPA誘導的表皮增生的結果表明：通過HB-EGF下調EGF-R水平，而EGF-R信號對HB-EGF的應答表現(xiàn)為培養(yǎng)的GnT-V缺陷小鼠的角質形成細胞的下調。此外，對條件培養(yǎng)基增加HB-EGF或TPA誘導培養(yǎng)的角質形成細胞上調GnT-V的表達[21]。增加的GnT-Ⅴ活性有助于增加β1-6GlcNAc N-聚糖EGF上的支鏈，導致晶格的形成，從而抑制細胞EGF-R內(nèi)吞作用，增強EGF-R的信號。因此，由HB-EGF調節(jié)的GnT-Ⅴ在細胞增殖過程中保持穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。正常和過度增殖性皮膚中的GnT-Ⅴ的作用又被稱為“GnT-V的皮膚循環(huán)”。GnT-Ⅴ和HB-EGF相互加強對方的表達和功能，具有協(xié)同作用。

3 GnT-V在脂肪性肝炎中的作用

雖然GnT-Ⅴ的表達在正常肝組織中是相當?shù)偷?，但在慢性肝炎和肝再生的條件下表達增加[16-17]。以前的研究已經(jīng)表明：糖基轉移酶的轉基因小鼠由于肝細胞中脂蛋白的積累可以發(fā)展為脂肪肝[21-22]。但是，在正常條件下，GnT-V Tg小鼠沒有表現(xiàn)出脂肪肝表型。其中一個原因是由于GnT-V Tg小鼠肝臟中GnT-V的表達量比其它器官低，與肝臟缺乏脂肪的轉化有關。非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是世界上最常見的慢性肝病之一，而在工業(yè)化國家產(chǎn)生越來越多的醫(yī)療問題[23]。已觀察NAFLD的組織學變化，從單純的脂肪變性（通常是非進展型的）到非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH），一部分NASH患者發(fā)展為肝硬化和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）[24]。最近的研究表明：在人類和嚙齒動物中，飲食中的膽固醇是NASH的一個重要的危險因素。

當給GnT-V Tg和野生型小鼠高脂肪和高膽固醇飲食，與野生型小鼠相比GnT-V Tg小鼠淋巴細胞浸潤被顯著抑制。高膽固醇飲食是小鼠NASH最好的模型之一，因為它能誘導小鼠肝臟的炎癥和纖維化[25]。由于慢性肝炎中的GnT-V的表達升高[16]，給GnT-V Tg小鼠高膽固醇飲食可作為了解在肝臟中上調GnT-V的生物學效應的手段[26]。當喂小鼠正常食物時，測定體重、肝臟重量和肝臟與體重比，野生型小鼠較GnT-V Tg小鼠均顯著較高。與此相反，高膽固醇飲食下野生型小鼠較GnT-V Tg小鼠在肝臟重量和肝臟與體重比顯著下降。正常飲食或高膽固醇飲食GnT-VTg小鼠比野生型小鼠血清甘油三酯，肝臟中甘油三酯或膽固醇含量無明顯差異。正常飲食下，GnT-VTg小鼠與野生型小鼠肝臟膽固醇沒有差異，但高膽固醇飲食下GnT-V Tg小鼠相比于野生型小鼠肝臟膽固醇水平顯著降低。GnT-V Tg小鼠肝中淋巴細胞浸潤抑制被認為是由于T細胞向Th2的轉變。因此，Th1細胞因子如白細胞介素-6、干擾素-γ、腫瘤壞死因子α水平在GnT-V Tg小鼠肝臟中受到顯抑制[26]。GnT-V Tg小鼠相比于野生型鼠血清谷丙轉氨酶水平也較低。

4 GnT-V Tg小鼠抑制肝臟纖維化的的分子機制

4周時與野生型小鼠相比，高膽固醇飲食喂養(yǎng)的GnT-V Tg小鼠肝臟纖維化受到了抑制。雖然肝纖維化與肝臟炎癥相關，胞外基質蛋白的積累取決于非實質細胞在肝臟的功能。肝星狀細胞（hepatic stellate cell, HSC）在肝非實質細胞纖維化中是最重要的角色[27]。HSC產(chǎn)生TGF-β，它是在纖維化過程中一個非常重要的細胞因子，TGF-β刺激HSC產(chǎn)生更多的TGF-β，產(chǎn)生正反饋。當原代培養(yǎng)的HSC用外源性TGF-β處理，GnT-V Tg小鼠的HSC與野生型小鼠同類細胞相比產(chǎn)生較高的TGF-β。甚至在沒有外源性TGF-β的情況下，RT-PCR結果顯示，轉移酶-V Tg的HSC中TGF-β的mRNA水平增加。這些結果表明GnT-V增強TGF-β的信號傳導，這是依賴于與EGF-R介導的機制[7]。細胞核Smad3基因是TGF-β是否信號增強的有用指標。HSC細胞質提取物Smad3的蛋白表達在TGF-β刺激后下降，在野生型和GnT-V Tg小鼠HSC的TGF-β刺激顯著增加了核Smad3的蛋白水平。有趣的是，核Smad3的蛋白水平相比于野生型小鼠GnT-V Tg的HSC在TGF-β刺激后顯著升高。這些結果表明，在HSC中GnT-V的轉基因小鼠的TGF-β信號傳導增強。然而，GnT-ⅤHSC的Ⅰ型膠原表達的顯著下降。與野生型HSC相比，GnT-V Tg小鼠的HSC中COX-2基因的表達水平升高，COX-2是 PGE2生產(chǎn)中的限速酶。已有報道HSC中，TGF-β刺激COX-2的表達，COX-2衍生的PGE2抑制TGF-β1誘導的膠原蛋白產(chǎn)生[28]。塞來昔布，是GnT-V Tg小鼠的HSC中COX-2的選擇性抑制劑，能降低PGE2產(chǎn)生和上調Ⅰ型膠原基因的表達。通過增強COX2表達，持續(xù)刺激TGF-β，此負反饋信號能夠降低GnT-V Tg小鼠的肝臟和HSC的膠原蛋白的表達。

5 展望

對小鼠進行涉及寡糖合成初始步驟的糖基敲除有時是致命的[29]。然而，敲除其它糖相關基因，該基因敲除小鼠比野生型小鼠常表現(xiàn)為有限的表型表達或只有很小的器官上的差別。在這種情況下，應該進行刺激實驗。在人類疾病中，特定基因的完全缺陷是相對罕見的。另一方面，涉及炎癥和再生的多個基因部分缺陷和一些基因的異常是常見的。在GnT-V Tg小鼠的皮膚和肝臟中觀察到的表型不能在正常條件下進行檢測。這些微觀和宏觀的改變可以導致疾病的發(fā)生，多個團隊利用轉基因和基因敲除小鼠進行實驗[30-31]。在糖生物學研究的新時代，這樣的實驗會產(chǎn)生小鼠涉及寡糖重塑性的疾病模型，GnT-V的轉基因小鼠進行腫瘤誘導，將是最有前途的研究。同樣重要的是要考慮在實驗中使用癌基因和轉基因小鼠。

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