神經(jīng)纖維瘤病II型發(fā)病機理的研究現(xiàn)況

左文靜 縱亮 楊仕明

1中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100853）

2南開大學（天津300071）

1 引言

神經(jīng)纖維瘤?。∟eurofibromatosis,NF），是由于神經(jīng)嵴細胞分化異常所導(dǎo)致的多系統(tǒng)、多器官損害性疾病，是人類神經(jīng)系統(tǒng)常見的遺傳病之一[1-2]。NF雖然屬于良性腫瘤，卻往往因受累部位廣泛、局部壓迫癥狀明顯而產(chǎn)生嚴重的臨床后果，按表型及致病基因不同可分為I型（NF-1）和II型（NF-2）兩類。與周圍脊神經(jīng)和皮膚病變?yōu)橹鞯腘F-1相比，NF-2主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（聽神經(jīng)、腦膜、脊髓等），最明顯的特征是雙側(cè)前庭神經(jīng)鞘膜瘤（又稱“聽神經(jīng)瘤”），同時可合并多發(fā)性腦膜瘤、室管膜瘤、其它腦神經(jīng)及脊神經(jīng)的神經(jīng)鞘瘤，因此又稱為中樞型神經(jīng)髓鞘瘤病[3-4]。

神經(jīng)纖維瘤病II型(neurofibromatosis type II，NF-2)是由于NF2基因突變導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳病，即前庭神經(jīng)（VIII）鞘膜瘤病。臨床以雙側(cè)聽神經(jīng)瘤(vestibular schwannomas,VSs)為特征性表現(xiàn)，常伴多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤及眼和皮膚等相關(guān)病變，即常合并有腦膜瘤、脊瘤瘤、星形細胞瘤以及脊旁后根神經(jīng)鞘瘤，皮膚腫瘤以神經(jīng)鞘瘤為主[5]。由于NF-2的病變部位特殊，對聽覺功能影響嚴重，致殘致死率較高，治療手段有限，因此近年來受到了臨床醫(yī)生和研究人員的廣泛關(guān)注。該病的群體發(fā)病率約1:33,000，平均發(fā)病年齡18-24歲[6]。其50%～78%為散發(fā)神經(jīng)鞘瘤，60%～84%為散發(fā)腦膜瘤和37%散發(fā)室管膜瘤伴NF2基因失活[7-8]。

2 NF-2基因結(jié)構(gòu)

NF2基因為定位于22q12.2染色體的抑癌基因，長約110 000bp，編碼區(qū)cDNA長為 1785bp，包含17個外顯子，其中僅前15個外顯子有致病性突變。NF2基因mRNA經(jīng)選擇性剪切形成多種mRNA亞型，常見的為Ⅰ亞型(缺失外顯子16)和Ⅱ亞型（包括全部外顯子），兩者約占90%，僅前者有抑制腫瘤生長作用；Ⅲ亞型（缺失外顯子15、16）較少，且較Ⅰ亞型活性低[9]

NF2的基因產(chǎn)物(schwannomin/merlin)——Merlin蛋白包含595個氨基酸，與紅細胞膜蛋白4.1超家族(ezrinradixin-moesin，ERM)蛋白高度同源，是一種細胞骨架連接蛋白，包括FERM域（N-末端，1-8號外顯子）、連接區(qū)（9號外顯子）、α-螺旋區(qū)（10-13號外顯子）和C-末端，與細胞膜穩(wěn)定性、細胞間黏聚及細胞與胞外基質(zhì)的黏附關(guān)系密切[10-11]。與ERM類不同的是，MerlinC-末端缺少保守的與肌動蛋白結(jié)合的基序，同時突變往往導(dǎo)致C-末端功能異常[12-13]。

Merlin蛋白作為細胞骨架和跨膜蛋白的連接者，可以獲取周圍微環(huán)境中的信息而調(diào)控細胞分裂。細胞分裂的接觸抑制對于維持組織穩(wěn)態(tài)是不可或缺的，它的功能喪失是細胞轉(zhuǎn)化的一個標志，并且會導(dǎo)致腫瘤細胞的分裂、遷移和侵襲?，F(xiàn)有研究認為[14]，鈣黏素的參與或者有絲分裂信號的喪失可激活PAK信號通路，進一步導(dǎo)致Merlin閉合結(jié)構(gòu)增多而引起Merlin活化。在細胞高密度時，Merlin處于超磷酸化狀態(tài)而抑制細胞生長;在細胞低密度時，Merlin磷酸化并與ezrin，Moesin及CD44形成復(fù)合物，促進細胞生長，而Merlin的失活導(dǎo)致細胞間接觸抑制喪失并加速了細胞周期進程[15]。CD44通過與Merlin相互作用調(diào)節(jié)接觸抑制-依賴性細胞生長，被認為是控制細胞生長停滯和增殖的節(jié)點。它是一種跨膜透明質(zhì)酸受體，涉及細胞的侵襲、黏附和遷移[16]。

3 NF-2突變相關(guān)致病機制

研究發(fā)現(xiàn)，多種分子以配體形式與Merlin相互作用，通過調(diào)節(jié)細胞之間的接觸（如增加細胞-細胞接觸及細胞-基質(zhì)間的黏附功能）和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（如通過改變生長因子產(chǎn)生和發(fā)揮作用的微環(huán)境而防止異常的細胞周期產(chǎn)生）等途徑調(diào)節(jié)細胞的生長速度和運動能力，從而發(fā)揮腫瘤抑制功能。根據(jù)功能不同，這些配體大致分為3類：第1類主要是細胞表面糖蛋白，如細胞黏附分子CD44和β1整合素[17]。第2類是與肌動蛋白細胞骨架有關(guān)的分子，其功能和調(diào)節(jié)細胞運動有關(guān)[18]。第3類Merlin配體參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外離子的轉(zhuǎn)運，如Na+-H+離子交換調(diào)節(jié)因子(sodium hydrogen exchange regulatory factor,hNE-RF)和細胞胞飲等功能，包括肝細胞生長調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶的底物(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate,HRS)[19]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，NF2基因突變可在多種細胞中發(fā)生，常出現(xiàn)除生殖細胞突變外同時存在體細胞突變的嵌合現(xiàn)象（mosaicism），家族單一病例中即有25%-30%為嵌合體[14,15]。此外，NF2基因相關(guān)突變類型多種多樣，基因型-表型的對應(yīng)關(guān)系異常復(fù)雜，其中約有50%的NF-2患者的NF2突變遺傳自患病父母，另有50%患者為自身新發(fā)突變（de novo mutations）[20]。值得注意的是某個特定突變由親代向子代傳遞過程中，往往存在形式各異的不同臨床表型。因此，歸納來說，NF2突變大致可分生殖細胞突變和體細胞突變兩類，相比之下，前者以無義突變和剪切位點突變?yōu)橹?后者以移碼突變?yōu)橹鳌?0%典型NF2病例是由生殖細胞NF2基因突變所致。生殖細胞突變包括單一點突變、多外顯子點突變、整個基因缺失和染色體重組。最常見的突變類型為單一點突變，常導(dǎo)致Merlin蛋白C-末端缺失或改變[21]。而單一突變在NF2基因中呈不均勻分布，2、6、8和11號外顯子每個堿基對突變率為0.069%～0.118%，而9號外顯子僅為0.013%；突變率最高的位點是第169、586、784和1021堿基的CpG二核苷酸，CGA均經(jīng)C-T轉(zhuǎn)化為TGA形成無義突變。9和14號外顯子的突變均非無義突變。聚集在2和3號外顯子中不到10%的非截短突變可影響剪切作用，提示2和3號外顯子對Merlin或其腫瘤抑制活性非常重要[22]。

現(xiàn)有進行NF2基因檢測的方法，主要有：Evans等采用聯(lián)合全部外顯子直接序列分析和多重連接探針擴增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA），突變檢測的敏感率可提高到91%～95%[23]。Sestini等采用半自動高效液相色譜法(denaturinghigh performance liquid chromatography，DHPLC)聯(lián)合MLPA檢測患者點突變及篩查基因重排情況，同時評估了用于篩查外顯子確定點突變的高分辨溶解曲線分析方法(high-resolution melting analysis，HRMA)?；贖RMA方法的簡單、快速、低成本、高靈敏性及與DHPLC的高度一致性，Sestini等推薦HRMA作為NF-2患者的診斷性篩查技術(shù)[24]。NF2基因檢測技術(shù)除上述外還有毛細管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)和異源雙鏈核酸分子分析、微陣列-比較基因組雜交技術(shù)及熒光原位雜交技術(shù)等。

Merlin作為腫瘤抑制蛋白的作用機制尚不明確[25]。以上所述現(xiàn)象說明了NF-2相關(guān)神經(jīng)纖維瘤病發(fā)病機制異常復(fù)雜且存在高度異質(zhì)性，而這些令研究人員一籌莫展的科學問題背后所對應(yīng)的已知分子機制僅為“冰山一角”。因此，獲得不同突變位點的轉(zhuǎn)基因動物模型，并借此進行比照研究，是深入解析NF-2相關(guān)神經(jīng)纖維瘤病發(fā)病機理的先決條件。

4 NF-2已建立的動物模型

目前各國的學者們通過努力建立了大量攜帶不同nf2位點突變的動物模型，用來研究NF-2的發(fā)病機理。例如Jeffrey R.Gehlhausen及其同事們報道了條件純合子nf2基因敲除小鼠在雪旺細胞中以Cre介導(dǎo)的nf2外顯子2切除，表現(xiàn)為2型神經(jīng)纖維瘤病的特點。他們建立的Postn-Cre;Nf2flox/flox腫瘤模型可能在將來為NF-2相關(guān)神經(jīng)鞘瘤的機制和治療研究提供了一種新的工具[26]。Marco Giovannini及其同事們將nf2和p53單獨雜交，產(chǎn)生nf2；p53雙雜合子攜帶易位突變，然后再與野生型小鼠交配，得到了Nf 2/-；p5 3/-cis小鼠[27]。Jeremie Vitte及其同事們建立了不同組織和發(fā)育階段的條件基因敲除小鼠，攜帶SMARCB 1和/或NF2缺失，早期神經(jīng)嵴的SMARCB 1缺失是啟動具有典型組織學特征和人橫紋肌樣腫瘤典型的組織學特征和分子特征的腦神經(jīng)和腦膜的腫瘤發(fā)生的必要條件，除了在wschn細胞系的發(fā)育后期誘導(dǎo)SMARCB 1缺失外，還需要在wschn細胞株中誘導(dǎo)SMARCB 1缺失。雙等位基因nf2基因失活，則建立了第一只小鼠神經(jīng)鞘瘤模型，在神經(jīng)鞘瘤病患者中發(fā)現(xiàn)了相同的潛在基因突變[28]。Andrea I.McClatchey及其同事們從3個原始目標ES細胞克隆到野生型C57BL/6或129/SV動物培育嵌合體，獲得了99只Nf2/-和23個野生型F1(C57BL/6×129/SV)同胞和37只近交系129/SV Nf2/-動物；還通過雜交Nf2/-F1小鼠產(chǎn)生了45只Nf2/-F2動物來研究NF-2的發(fā)病機理[29]。

目前已報道大量攜帶不同nf2位點突變的小鼠動物模型，然而這些來源于小型的嚙齒類動物模型目前仍然存在諸多缺陷。例如nf2半合子小鼠不發(fā)生神經(jīng)鞘瘤，主要是骨肉瘤6；與人NF-2患者相比，Nf2/-小鼠在生命后期（10-30個月）發(fā)展出多種惡性腫瘤，這與人NF-2患者的疾病發(fā)展進程不同等等。而其它動物的NF-2模型暫未見報道。

5 展望

（1）生物信息學的快速發(fā)展使系統(tǒng)性研究疾病機制成為可能。近年來，隨著二代測序及質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，使新型高通量組學分析越來越多的應(yīng)用于各種人類疾病的機制研究[30]。這種以數(shù)據(jù)為導(dǎo)向,大規(guī)模、系統(tǒng)化的研究模式,使科研人員能夠從基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及翻譯后修飾組等不同水平對疾病展開全方位、多層次、跨維度的系統(tǒng)性機制研究成為可能。

由此我們相信，目前高通量組學及大數(shù)據(jù)分析手段能夠為深度解析NF-2相關(guān)聽神經(jīng)髓鞘瘤病理機制提供必要的技術(shù)保障。借助上述技術(shù)對臨床病理組織進行深度解析將大大提高獲得潛在治療靶點的可能性。然而由于現(xiàn)有臨床病理樣本取材過程中，幾乎無法取得正常人體聽神經(jīng)組織標本，這項不足嚴重制約了此類疾病相關(guān)分子關(guān)機制的研究進展。因此獲得與人類神經(jīng)纖維瘤病癥狀一致（或相似）的實驗動物模型是該領(lǐng)域研究工作的當務(wù)之急。

（2）建立大型實驗動物模型的需求。盡管目前大量NF-2相關(guān)腫瘤疾病研究仍以小鼠為主要實驗動物模型，然而鑒于物種間親緣關(guān)系差距較大，許多NF2基因缺陷導(dǎo)致的人類疾病表型（如神經(jīng)纖維瘤病）在小鼠模型中無法復(fù)制，這意味著nf2基因缺陷小鼠不是精確代表人類NF-2疾病表型的實驗動物模型，因此其無法勝任后續(xù)將開展的聽神經(jīng)纖維瘤相關(guān)的高通量組學研究。因此目前急需在與人類親緣關(guān)系更近，且適合用于疾病模型研究的常見物種中建立新型NF-2缺陷相關(guān)神經(jīng)纖維瘤病實驗?zāi)Ｐ蛣游颷31]。

因此，未來的研究應(yīng)在大型實驗動物基因組中引入人NF2基因的同源性致病突變位點，這可能出現(xiàn)與人類相關(guān)位點突變相一致的疾病表型，如獲成功有望填補目前暫無神經(jīng)纖維瘤病實驗動物模型的這項空白。不僅可以促進更好地研究NF2疾病的發(fā)病機理，還使得系統(tǒng)性機制研究成為可能。