基因分型技術(shù)在單核細(xì)胞增生性李斯特菌監(jiān)測溯源上的應(yīng)用

蔣 兵， 謝建華， 汪子淳， 梁望旺， 楊澤林， 藺 露， 張婷娟，彭遠(yuǎn)義，聶 奎，方仁東

（1.西南大學(xué) 動物科技學(xué)院，重慶400715；2.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心，重慶市豬主要傳染病防治工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部動物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險評估實驗室，重慶401120）

單核細(xì)胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes（以下簡稱單增李斯特菌）是一種重要的食源性人畜共患病原菌，人類的感染能夠引發(fā)腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)等疾病。李斯特菌病因其較高的致死率使其成為僅次于沙門氏菌Salmonella感染的致命食源性疾病，尤其對孕婦、嬰兒、老人等免疫力低下人群風(fēng)險極高［1－2］。單增李斯特菌的危險性目前已引起了世界各國的關(guān)注，中國與其他許多國家將其列為進(jìn)出口食品的必檢項目。根據(jù)美國食品網(wǎng)的調(diào)查顯示［3］，美國每年約2 600人感染單增李斯特菌，造成約260人死亡，在所有食源性疾病引起的死亡中，李斯特菌病占30%。據(jù)報道，中國大部分省市每年均有人和動物感染單增李斯特菌［4］。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，主要以食物為傳播媒介，特別在食品儲運及加工過程中極易受單增李斯特菌污染。人類的李斯特菌病大多是通過食用受污染的肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、速凍食品、乳制品和蔬菜等多種食品所致［5］。單增李斯特菌的致病力與其血清型密切相關(guān)。目前，在食物和環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的單增李斯特菌血清型有16種，與人類疾病相關(guān)的血清型主要有4b，1/2a和1/2b［6］，但不同來源的分離株其毒力、致病性、耐藥性等也存在較大差異［7］。鑒于李斯特菌病對人類健康構(gòu)成極大的威脅，預(yù)防和控制這類疾病需要建立一個長期的追蹤和調(diào)查方案，采用細(xì)菌溯源技術(shù)，通過亞種分型，能夠準(zhǔn)確、迅速地確定單增李斯特菌分離株的來源，鑒定比較致病菌株間的差別，為致病菌的溯源和疾病防控提供明晰可靠的科學(xué)資料［8－9］。近年來，食源性致病菌分子溯源分型技術(shù)發(fā)展較快，主要分為3類：①基于酶切技術(shù)的分型方法，包括脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）分型；②基于DNA測序技術(shù)的分型方法，包括多位點序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）和全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）；③基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增技術(shù)的分型方法，包括多位點可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列分析（multi-locus variable-number of tandem repeats analysis，MLVA）， DiversiLab 系統(tǒng)和 CRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins）系統(tǒng)。本文就以上述3類基因分型方法在單增李斯特菌監(jiān)測溯源中的應(yīng)用做一綜述。

1 基于酶切技術(shù)的分型方法

PFGE分型的基本原理是通過限制性內(nèi)切酶切割DNA特異性位點，利用瓊脂糖凝膠分離成大量的片段從而得出一組細(xì)菌帶型。使用不同的限制性內(nèi)切酶能夠產(chǎn)生不同的帶型，該技術(shù)通過利用多種限制性內(nèi)切酶來提高分辨力，更深層次地對菌株間基因相關(guān)性進(jìn)行分析。在食源性致病菌分子流行病學(xué)和溯源性追蹤研究方面，PFGE已成為基因分型方法的 “金標(biāo)準(zhǔn)”［10］。有研究利用PFGE評估單增李斯特菌在家禽食品生產(chǎn)中的污染情況，發(fā)現(xiàn)在家禽生產(chǎn)鏈中多個環(huán)節(jié)存在潛在的單增李斯特菌污染風(fēng)險［11］。此外，LEONG等［12］采用PFGE分型技術(shù)對48個食品加工設(shè)備中分離的單增李斯特菌進(jìn)行分型，結(jié)果顯示在多個食品加工設(shè)備中檢測出PFGE圖譜相同的菌株，表明污染源的傳播方向是從加工環(huán)境到食品。FUGETT等［13］結(jié)合AscI和ApaI酶對不同來源的單增李斯特菌進(jìn)行PFGE分型，結(jié)果顯示：從洛杉磯一起暴發(fā)病例中分離到的單增李斯特菌與瑞士暴發(fā)病例中分離到的單增李斯特菌具有相同的PFGE圖譜，表明二者具有較近的親緣關(guān)系。為調(diào)查因單增李斯特菌引發(fā)食物中毒事件中的污染源，LOMONACO等［14］利用PFGE型方法成功地追蹤到本次事件與食用受污染的香瓜Cucumis melo有關(guān)。上述究結(jié)果表明：PFGE在全基因組的水平上對病原菌進(jìn)行分型，相同菌株在不同實驗室進(jìn)行試驗均能得到相同分型圖譜，分型指數(shù)往往在0.95以上，與傳統(tǒng)核糖體分型相比其重復(fù)性更好、分辨力更高，目前該技術(shù)已成為多種細(xì)菌追蹤溯源、分型鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查的常規(guī)工具之一。

通過建立PFGE分型方法標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程，結(jié)合互聯(lián)網(wǎng)平臺實現(xiàn)實驗室間數(shù)據(jù)共享及比對，這對于食源性病原菌暴發(fā)事件的追蹤調(diào)查具有重要意義［15－16］。美國PulseNet已歸納整理了13 284個單增李斯特菌PFGE圖譜，其中有人類7 576個，食品2 863個，環(huán)境2 799個以及動物46個（Joseph Lavin,personal communication）。目前，有一些國家正在進(jìn)行類似的PFGE研究，利用不同國家和地區(qū)的研究成果通過網(wǎng)絡(luò)共享平臺可建立一個全球PulseNet（http：//www.pulsenetinternational.org/protocols/pfge/）數(shù)據(jù)庫。盡管PFGE分型過程存在耗時長、成本高、操作復(fù)雜、帶型之間比對困難等不足，但PFGE的優(yōu)勢在于能對所有的單增李斯特菌分離株進(jìn)行有效分型，使得該項技術(shù)成為目前單增李斯特菌基因分型的最優(yōu)分型方法。

2 基于DNA測序的分型方法

2.1 WGS分型

近年來，WGS技術(shù)正逐步應(yīng)用于病原菌的暴發(fā)調(diào)查和分型鑒定中。WGS分型是指利用測序技術(shù)對病原菌整個基因組堿基序列進(jìn)行測序，在全面了解病原菌的遺傳信息與變異特征的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因分型，提高了菌株進(jìn)化和溯源分析的分辨力，有助于快速地進(jìn)行暴發(fā)識別并追蹤傳染源。目前，用于病原菌全基因組測序分型的方法主要有2種：基于全基因組的單核苷酸多態(tài)性分型（wgSNP）和基于全基因組的多位點序列分型（wgMLST）。全基因組測序分型方法在腸炎沙門菌Salmonella enteritides，單增李斯特菌，霍亂弧菌Vibrio cholerae，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus中已得到初步應(yīng)用。有研究對引發(fā)人類李斯特菌病相關(guān)聯(lián)的病原菌進(jìn)行WGS分型，進(jìn)一步追蹤其污染源。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該方法不僅能精確定位污染源，同時還能根據(jù)單核苷酸多態(tài)性分析菌株在該時段的進(jìn)化關(guān)系［17］。FAGERLUND等［18］對長期引起某食品工廠污染的ST8型單增李斯特菌進(jìn)行WGS分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株同之前丹麥和挪威暴發(fā)食品污染事件的ST8型單增李斯特菌的wgSNP分析結(jié)果幾乎完全相同，此研究結(jié)果表明：食品加工環(huán)境中持續(xù)存在的致病性菌株易于傳播，是威脅食品加工廠安全的重要因素。另外，RUPPITSCH等［19］用wgMLST分析方法對單增李斯特菌進(jìn)行分型，結(jié)果顯示：基于DNA測序分析的wgMLST方法與PFGE分型相比對單增李斯特菌具有更高的分辨率和靈敏度，能對食源性疾病暴發(fā)源頭進(jìn)行精確確認(rèn)。

WGS分型結(jié)果包含了病原菌全部的遺傳信息，有利于毒力基因、耐藥基因的篩選，結(jié)合序列比對軟件更易發(fā)現(xiàn)基因組的變異特征［20］。在MLVA分型中，利用重復(fù)序列分析軟件Tandem Repeat Finder可對WGS序列進(jìn)行搜索，直接確定重復(fù)序列數(shù)目。WGS分型方法在病原菌的暴發(fā)調(diào)查和監(jiān)控上與傳統(tǒng)基因分型方法（PFGE，MLST，MLVA等）相比其分辨力和靈敏度更高、重復(fù)性更好，且便于數(shù)據(jù)比對［18］。此外，不同實驗室之間可通過國際PulseNet（http：//www.pulsenetinternational.org/protocols/wgs/）網(wǎng)絡(luò)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行全球數(shù)據(jù)的交流和共享。在食源性致病菌的暴發(fā)識別和溯源分析中，WGS正逐漸成為一個準(zhǔn)確、快速、高效的鑒定工具。

2.2 MLST分型

MLST是在多位點酶切電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上為研究菌群基因結(jié)構(gòu)而設(shè)計的一種高分辨率分型技術(shù)。該技術(shù)通過PCR擴(kuò)增7個管家基因內(nèi)部具有足夠變異度的等位基因并對其產(chǎn)物進(jìn)行測序。經(jīng)MLST數(shù)據(jù)庫分析后得出每個菌株各個位點的等位基因序號，將這些等位基因序號組合構(gòu)成一個等位基因圖譜，即序列類型（sequences type，STs）［21］。MLST分型方法在與人類李斯特菌病爆發(fā)和散發(fā)相關(guān)的流行病學(xué)研究方面已得到廣泛應(yīng)用。有研究利用MLST分型技術(shù)探究單增李斯特菌種群進(jìn)化關(guān)系［22］，結(jié)果顯示單增李斯特菌的進(jìn)化主要是菌株不斷突變的結(jié)果。另有研究利用3種方法對71株單增李斯特菌進(jìn)行基因分型，認(rèn)為在單增李斯特菌的分型研究中MLST的分辨力優(yōu)于血清分型和PFGE，可用于追蹤暴發(fā)疫情的傳染源［23］。WANG等［24］研究表明：國內(nèi)12個省分離的212株單增李斯特菌中部分ST型別屬于國內(nèi)外潛在可能傳播和暴發(fā)李斯特菌病的STs型。再者，WU等［25］用MLST方法對國內(nèi)零售的即食性食品（RTE）中分離出80株單增李斯特菌分型分析，發(fā)現(xiàn)部分菌株的STs型與人類李斯特菌病和不同地區(qū)的暴發(fā)事件相關(guān)。

細(xì)菌分型溯源技術(shù)種類繁多，MLST以其簡便快速，重復(fù)性強(qiáng)，分辨率高和數(shù)據(jù)可共享等優(yōu)勢在一定程度上滿足了流行病學(xué)研究發(fā)展的要求。目前，已建立了多種病原菌的MLST數(shù)據(jù)庫，巴斯德研究所根據(jù)單增李斯特菌MLST分型的7個管家基因（acbZ，bglA，cat，dapE，dat，ldh，lhk）建立了用于單增李斯特菌 MLST 分型的數(shù)據(jù)庫（http：//www.pasteur.fr/fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.html）［25］。 隨著新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)，wgMLST分型方法能同時將成百上千個基因位點的序列進(jìn)行比對，與傳統(tǒng)的7位點MLST基因分型方法相比具有更高的分辨力。但2種MLST分型方法均需要測序，使用成本較高。相信隨著測序技術(shù)的發(fā)展，測序費用的降低，在不久的將來MLST分型技術(shù)有望成為某些細(xì)菌分型的 “金標(biāo)準(zhǔn)”。

3 基于PCR擴(kuò)增的分型方法

3.1 MLVA分型

MLVA分型是以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的基因分型方法之一，該方法利用存在于病原菌基因組DNA特殊位點中的大量可變串聯(lián)重復(fù)序列作為檢測靶標(biāo)，設(shè)計特異性引物對每個位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)生不同大小的片段，通過毛細(xì)管電泳確定擴(kuò)增產(chǎn)物大小，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為每個位點的重復(fù)數(shù)，最終以一系列串聯(lián)數(shù)字的形式來表示一個菌株型別。所有的細(xì)菌基因組序列都包含不同程度的串聯(lián)重復(fù)數(shù)，這為細(xì)菌遺傳多樣性提供有關(guān)功能、進(jìn)化及分型方面的重要信息。有研究對91株單增李斯特菌進(jìn)行MLVA分型，結(jié)果顯示該方法分辨力較高，可作為一線檢測方法用于李斯特菌病的暴發(fā)確認(rèn)和溯源檢測［26］。此外，SALEHLAKHA等［27］利用MLVA方法對2 421株單增李斯特菌進(jìn)行分型，并建立了關(guān)于2 421株單增李斯特菌MLVA分型結(jié)果的數(shù)據(jù)庫，用于單增李斯特菌的流行病學(xué)監(jiān)測和溯源研究。在MLVA分型方法的初步應(yīng)用中，LUNESTAD等［28］對農(nóng)場和食品加工廠分離的65株單增李斯特菌進(jìn)行MLVA分型時發(fā)現(xiàn)，其中1個MLVA圖譜與曾經(jīng)多次在本地區(qū)暴發(fā)的李斯特菌病病原菌圖譜一致，表明消費一些魚類產(chǎn)品僅僅是引起食源性李斯特菌病流行的可能因素之一。同樣地，DASS等［29］研究發(fā)現(xiàn)，造成冷凍熏鯉魚加工廠單增李斯特菌污染的污染源除了來源于生產(chǎn)線外，還可能是原材料攜帶污染源并通過生產(chǎn)加工線傳播，最終導(dǎo)致成品冷凍熏鯉魚的污染。

MLVA方法在大腸埃希菌Escherichia coli，單增李斯特菌和沙門氏菌等的分型研究中已得到廣泛應(yīng)用，并建立了國際PulseNet（http：//www.pulsenetinternational.org/protocols/mlva/）網(wǎng)絡(luò)在線數(shù)據(jù)庫，用于全球范圍內(nèi)MLVA分型結(jié)果的共享與比較，從而為大范圍細(xì)菌暴發(fā)事件的確認(rèn)提供有利的數(shù)據(jù)支撐。MLVA方法不僅具有方便快捷、重復(fù)性好、高通量等優(yōu)勢，其分型結(jié)果能夠以數(shù)字化的形式顯示，降低了之前瓊脂糖凝膠電泳分析過程中產(chǎn)生的主觀影響，更利于資料的分析、共享和比較。雖然該方法已在細(xì)菌流行病學(xué)分析和溯源研究中廣泛應(yīng)用，但因其需要專門的序列分析儀器，同時試劑費用昂貴，故在普通實驗室還難以普及。

3.2 DiversiLab分型

DiversiLab是以repetitive-sequence-based PCR（rep-PCR）技術(shù)為原理的自動化基因分型系統(tǒng)。通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因組的非編碼重復(fù)序列，再將擴(kuò)增片段在Agilent 2100自動生物分析儀上進(jìn)行微流體電泳分離，并使用軟件實時分析和處理數(shù)據(jù)對細(xì)菌進(jìn)行基因分型［30］。該方法通過電泳產(chǎn)生的特異性指紋圖譜來比較菌株間的相似性，提高了其分型能力，能對環(huán)境及食品樣品中的病原微生物進(jìn)行有效地監(jiān)測和追蹤。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和真菌的分子流行病學(xué)研究。有研究利用DiversiLab分型系統(tǒng)對食品中分離出的25株單增李斯特菌進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示某類食品在加工過程中通過不同或相同的途徑污染了相同的單增李斯特菌，除此之外還有一些相同來源的菌株已發(fā)生變異［31－32］。另有研究對91株單增李斯特菌的同源性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有菌株的rep-PCR型相似度較低，表明該地區(qū)單增李斯特菌的rep-PCR型存在多樣性［33］。此外，ROUSSEL等［34］將DiversiLab分型系統(tǒng)同PFGE相比較，發(fā)現(xiàn)DiversiLab分型系統(tǒng)更適用于食品加工過程和環(huán)境中污染源的快速追蹤。綜合上述文獻(xiàn)資料和數(shù)據(jù)可知，DiversiLab系統(tǒng)一次能對12個樣本進(jìn)行分析，總操作時長大約6～8 h，是單增李斯特菌暴發(fā)流行普查階段最理想的分型方法。

DiversiLab系統(tǒng)分型與PFGE分型結(jié)果有良好的一致性［35－36］，相對于分型 “金標(biāo)準(zhǔn)”的PFGE來說，其重復(fù)性更高，操作流程更簡便，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)易于標(biāo)準(zhǔn)化［37］，可作為快速分型或暴發(fā)疫情的流行病學(xué)分析首選分型方法。DiversiLab分型系統(tǒng)在食源性致病菌的主動監(jiān)測及病原體溯源等方面具有重要的應(yīng)用價值，但DiversiLab分型系統(tǒng)也存在一定的局限性。該系統(tǒng)試劑成本較高，需要昂貴的儀器設(shè)備，對實驗操作人員的專業(yè)素養(yǎng)要求較高，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)還不夠明確。這些問題都亟待進(jìn)一步探討和解決。

3.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)分型

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）序列由一種成簇的、有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列構(gòu)成，其與周圍的一些輔助蛋白（Cas）共同組成CRISPR-Cas系統(tǒng)（簡稱CASS系統(tǒng)）。該系統(tǒng)是細(xì)菌通過基因水平轉(zhuǎn)移而形成的一種獲得性免疫系統(tǒng)，與細(xì)菌抵抗外源遺傳物質(zhì)入侵有關(guān)。根據(jù)CASS系統(tǒng)中的Cas蛋白和識別機(jī)制的不同，CASS系統(tǒng)分為3個不同的類型，即TypeⅠ，TypeⅡ和TypeⅢ。典型的CASS系統(tǒng)主要由leader，repeat，spacer和一套cas基因組成，其中短的重復(fù)回文序列repeat是最核心的結(jié)構(gòu)，cas基因主要負(fù)責(zé)編碼修飾核酸的相關(guān)蛋白。根據(jù)細(xì)菌中是否存在CASS系統(tǒng)及細(xì)菌中spacer序列的數(shù)目和排列狀態(tài)特征可對細(xì)菌進(jìn)行基因分型［38］。目前已有研究利用CASS系統(tǒng)對空腸彎曲桿菌Campylobacter jejuni和沙門氏菌進(jìn)行基因分型，但關(guān)于CASS系統(tǒng)在單增李斯特菌上的應(yīng)用還未見報道。FABRE等［39］研究顯示CASS系統(tǒng)在操作程序和樣本通量上優(yōu)于PFGE，MLST，MLVA等分型方法，更適合于沙門氏菌的暴發(fā)調(diào)查。因此，在食源性疾病污染源的追蹤中，可利用CASS系統(tǒng)對環(huán)境和食品中病原菌的CRISPR結(jié)構(gòu)進(jìn)行測序分析，用于追蹤疫情傳染源和控制疫情蔓延。

4 展望

綜上所述，基因分型方法已成為單增李斯特菌流行病學(xué)研究的重要工具，在單增李斯特菌的暴發(fā)調(diào)查和溯源研究中，PFGE，MLST，MLVA等分型技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用。其中，PFGE技術(shù)具有高的再現(xiàn)性和分辨力，是病原微生物基因分型的 “金標(biāo)準(zhǔn)”；而有著更高分辨力和再現(xiàn)力的MLST新技術(shù)正在逐漸被使用；MLVA重復(fù)性好、高通量，有利于實驗室間數(shù)據(jù)交流共享；DiversiLab系統(tǒng)操作簡便，快速省時，易于標(biāo)準(zhǔn)化；CRISPR-Cas系統(tǒng)在操作程序和樣本通量上優(yōu)勢較大；WGS分型能結(jié)合多種基因分型方法對病原菌進(jìn)行分析，具有更高的分辨率和靈敏度。這些分型技術(shù)均具備一定的優(yōu)勢同時也存在不足之處，在實際應(yīng)用中可根據(jù)具體用途和各自的特點進(jìn)行選擇，但這些技術(shù)大多是針對病原菌基因組中的小部分遺傳信息進(jìn)行分析，對于高度克隆的菌株在分辨力上就略顯不足。而全基因組測序分型是對病原菌整個基因組堿基序列進(jìn)行分析，不僅提高了分型能力，還能鑒定分子血清型，篩選毒力基因、耐藥基因等。此外，利用全基因組測序獲得的序列信息，可同時對病原菌進(jìn)行MLST，MLVA，DiversiLab系統(tǒng)和CRISPR-Cas系統(tǒng)分型，不僅提高了分型的準(zhǔn)確性，也有利于不同分型方法的比較。但全基因組測序技術(shù)目前還存在測序耗時長，費用昂貴等不足，在推廣上還存在難度。相信未來在確定病原菌的親緣關(guān)系、追蹤傳染源、控制疫情的暴發(fā)和傳播等方面，基因分型技術(shù)將以其準(zhǔn)確、快速、高分辨力、高重復(fù)性、易于交流分享等優(yōu)勢會受到越來越多研究者的青睞。

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“敢為人先、搶抓機(jī)遇”。蘇州人民敢于爭第一、勇于創(chuàng)唯一，“第一”和“唯一”的背后是認(rèn)清大勢、搶抓機(jī)遇。改革開放后，蘇州誕生了全國第一個自主開發(fā)的工業(yè)小區(qū)、第一個與國外合作開發(fā)的工業(yè)園區(qū)、第一個封關(guān)運作的出口加工區(qū)、第一個設(shè)在縣級市的國家級高新區(qū)、唯一一個深化兩岸產(chǎn)業(yè)合作試驗區(qū)和開展開放創(chuàng)新綜合試驗的開發(fā)區(qū)，這無一不是“闖”的結(jié)果，無一不是“敢為人先”的探索。黨的十八大以來，蘇州還在全面深化改革方面先行先試，爭取到一大批含金量較高、對全市經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展?fàn)恳饔幂^大的改革試點，蘇州工業(yè)園區(qū)開放創(chuàng)新綜合試驗累計實施130項重點改革任務(wù)。

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