殼聚糖復(fù)合材料在骨修復(fù)領(lǐng)域的研究進(jìn)展

陸 遙，尹慶水，夏 虹

殼聚糖是一種天然高分子聚合物，具有良好的生物相容性和生物活性，但存在力學(xué)性能較差的缺點(diǎn)，在骨修復(fù)應(yīng)用中受到了限制。針對這一缺陷，人們開始研發(fā)和制備殼聚糖復(fù)合材料，提高力學(xué)性能，相關(guān)研究亦顯示其在骨修復(fù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景[1-4]。本文就殼聚糖復(fù)合材料在骨修復(fù)方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 殼聚糖的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，是甲殼素脫乙?；蟮玫降奶烊欢嗵?，由隨機(jī)分布的β-1，4-葡糖胺和N-乙酰-葡糖胺組成。甲殼素廣泛存在于甲殼類動(dòng)物（主要是蝦蟹）、昆蟲、真菌等生物中，是自然界儲(chǔ)量僅次于纖維素的天然多糖；但由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不溶于水，萃取難度高，甲殼素的研究和應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。殼聚糖是甲殼素最主要的衍生物，目前主要由化學(xué)法或生物法（酶或發(fā)酵）脫乙?；@得[5]。

除了具有良好的生物相容性和生物降解性之外，殼聚糖還具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化等多種生物活性[6-7]。其抗菌作用主要與分子量相關(guān)，低分子量殼聚糖可穿透細(xì)菌細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，抑制DNA轉(zhuǎn)錄和mRNA合成；高分子量殼聚糖則可結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞膜負(fù)電物質(zhì)上，改變膜通透性并阻斷養(yǎng)分運(yùn)輸[8]。殼聚糖還可增加白介素（interleukin，IL）1和2分泌，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞成熟和浸潤，起到抗腫瘤作用[9]，并可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。殼聚糖的抗氧化機(jī)制可能是其吡喃糖環(huán)上的氨基、羥基與不穩(wěn)定自由基發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而形成穩(wěn)定的自由基[11]。

目前殼聚糖已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及生物材料研究領(lǐng)域，但由于力學(xué)性能較差、脆性大、溶脹率較大，單純使用殼聚糖難以滿足作為骨修復(fù)材料的要求，因此，人們將殼聚糖與天然聚合物、生物活性陶瓷、人工合成聚合物、微納米材料等復(fù)合，借以提高其生物力學(xué)性能和成骨性能。

2 殼聚糖與天然聚合物復(fù)合在骨修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用

殼聚糖是迄今發(fā)現(xiàn)唯一表面帶有正電荷的天然多糖，其他天然聚合物在酸性環(huán)境中多為中性或負(fù)電，這一特性使得殼聚糖能夠與其他帶負(fù)電荷的天然聚合物形成靜電復(fù)合物，其中以殼聚糖-藻酸鹽復(fù)合材料最具代表性。

2.1 殼聚糖藻酸鹽復(fù)合材料

藻酸鹽是一種廣泛存在于藻類等生物體內(nèi)的天然多糖，具有良好的生物相容性、可降解性和低免疫原性[12]。與單純殼聚糖支架相比，殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合支架力學(xué)強(qiáng)度增高，利于成骨細(xì)胞黏附、增殖和分化，在體內(nèi)具有更加優(yōu)異的組織相容性和骨誘導(dǎo)能力[13]。

為進(jìn)一步增強(qiáng)該復(fù)合材料的成骨作用，人們加入生長因子或藥物等具有成骨誘導(dǎo)作用的物質(zhì)。Florczyk等[14]分別將間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、骨髓抽吸物及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）與殼聚糖/藻酸鹽支架復(fù)合，結(jié)果表明，復(fù)合支架可有效修復(fù)大鼠顱骨缺損，其中BMP-2復(fù)合支架的修復(fù)效果最佳。Soran等[15]將載有BMP-6的藻酸鹽微球與殼聚糖支架復(fù)合，顯著促進(jìn)了MSCs的成骨分化和礦化。Lu等[16]利用納米銅在溶液中緩釋銅離子的特性，制備了含銅羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉支架，該支架具有促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1黏附和成骨分化的作用，植入體內(nèi)后顯著促進(jìn)血管化新骨生成；由于銅離子具有很強(qiáng)的抗菌作用，該支架在體內(nèi)能夠有效抑制金黃色葡萄球菌的生長，可用于修復(fù)感染性骨缺損。綜上所述，殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合支架在成骨、抗菌和血管生成方面均起到積極作用，無論是對于創(chuàng)傷性還是感染性骨缺損，都有良好的應(yīng)用價(jià)值。

劑型方面，Park等[17]制備復(fù)合 MSCs、BMP-2的可注射殼聚糖/藻酸鹽凝膠，注射于裸鼠皮下12周后可生成具有骨小梁結(jié)構(gòu)的新生骨組織；Wang等[18]研制RGD多肽（精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸）接枝的氧化海藻酸鈉/琥珀酰殼聚糖水凝膠，低能量脈沖超聲刺激下可顯著促進(jìn)MSCs的增殖，定向誘導(dǎo)下則可促進(jìn)MSCs的成骨分化或血管內(nèi)皮分化，有助于血管化新骨形成。殼聚糖和藻酸鹽復(fù)合后還可制成微球，該微球可裝載成骨細(xì)胞，用于骨缺損的修復(fù)。有學(xué)者將制備的殼聚糖/藻酸鹽微球包封前成骨細(xì)胞后混入可注射骨水泥中，注射于裸鼠皮下，細(xì)胞示蹤結(jié)果顯示前成骨細(xì)胞在體內(nèi)2周時(shí)仍清晰可見，4周、8周后分別可觀察到層狀骨樣礦化和類骨質(zhì)結(jié)構(gòu)[19]?？傊瑲ぞ厶?藻酸鹽在劑型上具有靈活可塑性和多樣性的特點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)際需要制備成凝膠、微球、支架、復(fù)合骨水泥等相應(yīng)劑型，提高了骨修復(fù)效率。

2.2 殼聚糖/其他天然聚合物復(fù)合材料

Wang等[20]制備具有氣泡樣結(jié)構(gòu)的多孔羥乙基殼聚糖/纖維素水凝膠，對前成骨細(xì)胞的黏附和增殖具有促進(jìn)作用；Tong等[21]制備載有血管內(nèi)皮生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的殼聚糖/絲素蛋白支架，可顯著提高人胚胎成骨細(xì)胞的增殖能力和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表達(dá)水平；Yin 等[22]將載有BMP2及纖維生長因子2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）的微球加入殼聚糖/膠原支架中，結(jié)果證實(shí)該支架明顯促進(jìn)了骨膜衍生細(xì)胞（periosteum derived cells，PDCs）的成骨分化，進(jìn)而加速了大鼠顱骨缺損的修復(fù)進(jìn)程。亦有學(xué)者將殼聚糖與淀粉[23]、褐藻糖膠[24]等天然聚合物復(fù)合，觀察其作為骨修復(fù)材料的可行性，從而為尋找骨缺損治療新方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 殼聚糖與生物活性陶瓷復(fù)合在骨修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用

天然骨組織主要由有機(jī)物和無機(jī)物構(gòu)成，殼聚糖與無機(jī)物復(fù)合可以模擬天然骨組織的特征，是很有臨床應(yīng)用潛力的骨修復(fù)材料。

3.1 殼聚糖羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）復(fù)合材料

羥基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]是最穩(wěn)定的鈣磷復(fù)合物之一，也是天然骨骼的主要成分（占60%～65%）。殼聚糖與HA結(jié)合后可提高材料的力學(xué)性能和成骨性能。Zhang等[25]制備不同HA含量的殼聚糖/HA支架，結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞黏附、ALP活性、壓縮強(qiáng)度隨HA含量的增加而顯著提高。

3.1.1 復(fù)合材料活性的影響因素 復(fù)合材料的制備方法、大小形狀等因素均會(huì)對其生物活性產(chǎn)生影響。目前制備殼聚糖/HA復(fù)合材料的方法較多，常見的有物理攪拌法和原位沉積法。Chen等[26]的研究結(jié)果表明，無論是生物活性（MSCs增殖和ALP活性）還是壓縮強(qiáng)度，原位沉積法制備的殼聚糖/HA支架都優(yōu)于物理攪拌法制備的支架。

HA的尺寸和形狀也會(huì)影響材料的成骨作用。Lee等[27]比較殼聚糖/微米和殼聚糖/納米HA支架的體內(nèi)骨誘導(dǎo)能力，結(jié)果顯示后者新生骨骨體積、骨表面積、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量等指標(biāo)均優(yōu)于前者。Ji等[28]分別基于球狀和棒狀納米HA制備HA/殼聚糖/明膠支架，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在接種球狀納米HA制備的支架上增殖更快，成骨基因ALP、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達(dá)水平也更高；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)前種支架植入12周后可誘導(dǎo)大塊新生骨形成，而后種支架只有少量新骨生成。

3.1.2 復(fù)合材料的功能 除可作為細(xì)胞支架材料，為細(xì)胞黏附、生長和增殖提供良好的三維生長環(huán)境之外，殼聚糖/HA支架還可作為藥物載體，為腫瘤性和感染性骨缺損的修復(fù)提供新的治療思路。Lu等[29]采用原位沉積法制備載唑來膦酸/殼聚糖/納米HA支架，通過調(diào)整唑來膦酸的濃度來誘導(dǎo)骨巨細(xì)胞瘤凋亡，支架的生物安全性和成骨誘導(dǎo)性均良好；Zhang等[30]將載萬古霉素的介孔HA/殼聚糖復(fù)合支架植入含耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的兔肌袋中，發(fā)現(xiàn)局部萬古霉素有效抑菌濃度可持續(xù)4周，細(xì)菌增殖被顯著抑制；Sa等[31]研發(fā)一種含殼聚糖/甘油磷酸酯/nHA/慶大霉素的可注射骨水泥，結(jié)果提示，殼聚糖和活性材料的加入在不影響骨水泥力學(xué)性能的前提下增強(qiáng)了骨水泥的礦化能力和抗菌能力。

3.1.3 復(fù)合材料的形貌 天然骨組織具有三維多孔結(jié)構(gòu)，多孔支架模擬了天然骨結(jié)構(gòu)，適合骨細(xì)胞黏附、生長和增殖，是一種理想的骨修復(fù)材料。除了多孔支架之外，研究者還制備其他形貌的殼聚糖/HA骨缺損復(fù)合材料。Jiang等[32]制備殼聚糖/羧甲基纖維素/納米HA多孔薄膜，卷曲形成螺旋圓柱支架以模仿天然骨形態(tài)，植入新西蘭大白兔橈骨缺損處12周后可成功修復(fù)骨缺損；He等[33]制備一種可彎曲的甲殼素/HA薄膜，該薄膜可促進(jìn)前成骨細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的組織相容性和一定的降解性。

3.2 殼聚糖生物玻璃復(fù)合材料

生物玻璃是另一種廣泛應(yīng)用的陶瓷材料，具有良好的生物安全性和生物活性。Yang等[34]在殼聚糖支架表面修飾生物玻璃，其力學(xué)性能較純殼聚糖支架明顯提升，壓縮強(qiáng)度為（7.68±0.38）MPa，彈性模量為（0.46±0.02）GPa，與松質(zhì)骨力學(xué)強(qiáng)度相似。Khoshakhlagh等[35]制備可注射殼聚糖/生物玻璃復(fù)合物，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生物玻璃含量的增加可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖；大鼠脊柱融合模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證實(shí)，提高生物玻璃的含量可增強(qiáng)材料的骨誘導(dǎo)性。

此外，還有殼聚糖與磷酸鈣、硫酸鈣復(fù)合用于骨修復(fù)領(lǐng)域的研究[36-37]，這些復(fù)合材料具有良好的材料表征、生物安全性和骨誘導(dǎo)性，具備作為骨修復(fù)材料的潛力。

4 殼聚糖與人工合成聚合物復(fù)合在骨修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用

人工合成聚合物材料，如聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚 醚 醚 酮（polyetheretherketone，PEEK）、聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）、聚磷腈（polyphosphazene，PPZ）等，除了生物安全性良好之外，還具有降解率和機(jī)械強(qiáng)度可控，可制備形狀復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，批量生產(chǎn)成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)。但此類材料缺乏生物活性，僅有骨傳導(dǎo)功能，因此人們將殼聚糖與之復(fù)合，通過多種途徑，既提高支架的礦化和骨誘導(dǎo)能力，又增強(qiáng)人工聚合材料的生物活性，使其更適用于修復(fù)骨缺損。

Wang等[38]制備納米HA/殼聚糖/聚乳酸羥基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）支架，其壓縮模量和拉伸模量較PLGA、殼聚糖/PLGA、納米HA/PLGA支架增強(qiáng)；該支架可促進(jìn)人臍帶MSCs黏附和增殖，ALP和OCN表達(dá)水平亦顯著提高；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還表明，該支架載人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞植入裸鼠皮下后成骨誘導(dǎo)效果最佳。亦有學(xué)者將聚吡咯、藻酸鹽與殼聚糖混合，凍干制成的支架生物安全性良好，具有電刺激性，體外礦化效果較純殼聚糖支架顯著提高[39]。

為進(jìn)一步增強(qiáng)活性，Rogina等[40]采用3D打印技術(shù)制備孔徑為（960±50）μm的PLA多孔支架，借助冷凍凝膠技術(shù)在支架表面形成多孔殼聚糖-HA凝膠，表面改性后的支架壓縮強(qiáng)度和彈性模量較純PLA支架稍下降，與人MSCs共培養(yǎng)后細(xì)胞量、OCN和骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）表達(dá)均顯著升高，提示該支架成骨誘導(dǎo)能力更佳，適合骨修復(fù)。

5 殼聚糖與其他材料復(fù)合在骨修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用

研究者們將微納米材料與殼聚糖復(fù)合來提高材料性能。Sowjanya等[41]制備殼聚糖/藻酸鹽/納米二氧化硅（nSiO2）支架，結(jié)果顯示該支架的壓縮強(qiáng)度較殼聚糖/藻酸鹽支架下降，彈性模量無明顯差異，但材料的蛋白吸附能力和體外礦化能力顯著提高，有利于成骨。Fonseca-García等[42]制備殼聚糖/多壁碳納米管/納米HA支架，該支架對MSCs無明顯毒性，細(xì)胞接種后可維持CD90+CD73+CD166+的干細(xì)胞表型，保持了良好的成骨分化潛能。

Ruan等[43]將氧化石墨烯（約1 μm寬、1.5 nm高）和羧甲基殼聚糖通過共價(jià)交聯(lián)制成支架，其彈性模量和硬度分別較純羧甲基殼聚糖支架提高2.75倍和3.51倍；將支架與人脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞OPN、BSP、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix、OCN和ALP的表達(dá)水平均顯著升高；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦顯示該支架具有優(yōu)異的骨修復(fù)效果。

6 小結(jié)與展望

作為一種天然多糖，殼聚糖本身具有良好的生物相容性和抗菌活性，通過多種手段與聚合物（天然聚合物和人工聚合物）、HA、生物玻璃、微納米材料等復(fù)合后，可形成支架、微球、水凝膠、薄膜等多種形式的材料，用于不同類型的骨缺損修復(fù)。在此基礎(chǔ)上，殼聚糖還可作為生物活性因子和藥物的載體，復(fù)合后成骨能力進(jìn)一步增強(qiáng)，同時(shí)具有抗菌、抗腫瘤等功能，對于各種病因造成的骨缺損修復(fù)，均有良好的應(yīng)用前景。

但要真正投入臨床應(yīng)用，目前仍有許多未解之難題[44-45]。殼聚糖由甲殼素乙酰化形成，不同的脫乙酰度將導(dǎo)致其所形成的糖基、分子量和生物活性均不同，因此對于構(gòu)建骨修復(fù)材料的殼聚糖來說，如何找到最適合的脫乙酰度，亟待解決；殼聚糖和其他材料的配比將影響復(fù)合材料的性能和骨修復(fù)能力，其最佳配比仍需進(jìn)一步研究；殼聚糖降解產(chǎn)物對機(jī)體的影響也有待深入考查；骨修復(fù)過程中殼聚糖促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和成骨分化的機(jī)制亦尚需明確；隨著3D打印等數(shù)字技術(shù)在骨科材料制備中的應(yīng)用[46-47]，更多個(gè)性化殼聚糖復(fù)合骨修復(fù)材料亦有待研發(fā)，以滿足有效修復(fù)復(fù)雜骨缺損的需求?？傊?，殼聚糖是一種極具潛力的骨修復(fù)材料，相信在不久的將來，殼聚糖復(fù)合材料可實(shí)現(xiàn)真正的臨床應(yīng)用，為骨缺損修復(fù)治療開辟新的途徑。

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