誘導(dǎo)多能干細胞源性神經(jīng)干細胞用于治療腦梗死的現(xiàn)狀

劉爽 張卓伯

自誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)被發(fā)現(xiàn)以來它在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用越來越廣泛。本研究通過查閱文獻的方法對iPSC及其衍生物神經(jīng)干細胞(neural stem cells NSC)移植治療腦梗死的方法、結(jié)論進行概述，為干細胞移植治療腦梗死提供理論依據(jù)。

腦梗死又稱缺血性腦卒中(cerebral infarction)，是指因腦組織局部血液循環(huán)障礙，缺血缺氧引起的神經(jīng)功能障礙性疾病[1]。神經(jīng)細胞是一種永久細胞，一旦壞死后不可逆轉(zhuǎn)，腦梗死的發(fā)生會導(dǎo)致神經(jīng)功能的缺損甚至威脅生命。腦梗死在我國的發(fā)病率很高，約為110/10萬人口，腦梗死患者的病死率較高、生活質(zhì)量較差，對家庭和社會造成的負擔(dān)較重。目前多采用藥物或介入手術(shù)治療，尚未發(fā)現(xiàn)任何一種治療可以完全恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能。近些年來科學(xué)發(fā)現(xiàn)人類胚胎干細胞移植是一項新穎而有潛力的治療腦梗死的方法，已有動物實驗表明移植入小鼠體內(nèi)的胚胎干細胞具有多分化性，可以分化為神經(jīng)細胞，并且具有高度的自我復(fù)制能力，替代死亡的神經(jīng)細胞而發(fā)揮功能[2]。但是，由于胚胎干細胞需要使用胚胎細胞，存在倫理道德爭議，且異體移植會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，所以研究受到了限制。2006年誘導(dǎo)多能干細胞的發(fā)現(xiàn)解決了這一問題，日本Yamanaka[3]研究小組利用Oct3/4、Sox2、C-Myc 和Klf4 4種轉(zhuǎn)錄因子重新編碼小鼠胚胎成纖維細胞，成功獲得了生物特性與胚胎干細胞非常相似的細胞，稱為誘導(dǎo)多能干細胞。

iPSC相比于傳統(tǒng)的細胞重編程手段具有極大的優(yōu)勢。(1)iPSC受體細胞可來自體細胞，不需要使用卵母細胞或胚胎，可避免倫理及免疫排斥兩大問題；(2)來源廣泛。可以取自人B淋巴細胞[4]、肝細胞、胃細胞[5]、神經(jīng)細胞[6]等多種組織器官；(3)操作簡單，具有重復(fù)性。取材可以來自患有特定疾病的患者，從而實現(xiàn)患者個體化。例如可以取來自于患神經(jīng)退行性疾病患者的皮膚細胞，如肌萎縮側(cè)索硬化癥或帕金森氏病[7]，分化提取所需要的細胞類型，如運動神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元[8]，這使得人們在研究疾病發(fā)展的細胞和分子水平上達到了一個新高度；(4)增殖能力高。許多類型的細胞如神經(jīng)細胞只能進行有限數(shù)量的增殖，而重新編程后得到的iPSC仍然是二倍體細胞。這讓iPSC技術(shù)迅速取代了傳統(tǒng)的重編程手段, 向臨床應(yīng)用更近一步。

1 iPSC和NSC應(yīng)用于治療腦梗死

腦梗死與其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病不同，腦缺血發(fā)生后血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元都在一定程度上發(fā)生了破壞和死亡，因此與帕金森病只需要一種細胞不同，治療腦梗死需要細胞移植后分化的細胞種類更多,但是腦梗死是一次性的腦組織缺血損傷而非退行性改變，已經(jīng)缺血壞死的腦組織不會再持續(xù)的退化，因此細胞移植治療腦梗死不需要再進行基因修飾和重新編碼。Jiang等[9]在小鼠模型上初步完成了iPSC治療腦梗死的實驗，以評估治療的效果及風(fēng)險，雖然移植后小鼠的功能得到了改善，但發(fā)現(xiàn)大量的iPSC細胞經(jīng)移植后死亡，只有少量細胞存活，且存在高致瘤性的問題。有報道稱經(jīng)顱內(nèi)直接注射細胞較硬膜下腔注射的方法導(dǎo)致畸胎瘤的概率增高。有研究將纖維蛋白膠與iPSC混合后移植入腦梗死小鼠的硬膜下腔，觀察到小鼠的功能改善，梗死面積縮小，且在6周后未發(fā)現(xiàn)腫瘤的形成，說明纖維蛋白膠可以一定程度上降低腫瘤發(fā)生的概率[10]。

由于iPSC的較高致瘤性和較低存活率，將未分化的iPSC直接用于治療腦梗死是不可行的，而移植后的iPSC需要先分化為神經(jīng)干細胞(neural stem cells NSC)，才能進一步分化成為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，生理條件下人的腦組織側(cè)腦室的腦室下層及海馬齒狀回粒內(nèi)含有一定量的神經(jīng)干細胞，這些細胞以膠質(zhì)細胞的狀態(tài)存在而不發(fā)揮功能，當(dāng)神經(jīng)細胞受到損傷時這些神經(jīng)干細胞受到環(huán)境因素中某些信號因子的影響遷移、分化為神經(jīng)元而發(fā)揮功能。移植的NSC具有弱免疫原性的特點，進行細胞移植后很少發(fā)生免疫排斥的現(xiàn)象。此外，NSC的趨化性較強，由于微環(huán)境的作用，移植入體內(nèi)后可向病灶處遷移、增殖、分化。因此，有研究將iPSC-NSC移植應(yīng)用于治療腦梗死[11]，目前已有多種方法可在體外成功地將iPSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)干細胞[12-14]。有研究將人類iPSC-NSC移植到腦缺血大鼠的紋狀體，并使用MRI追蹤發(fā)現(xiàn)細胞經(jīng)注射區(qū)域沿著胼胝體遷移至腦梗死區(qū)域，與宿主細胞發(fā)生整合，取代受損的細胞重建神經(jīng)環(huán)路[15]。此外，神經(jīng)干細胞修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷可能還有以下機制：(1)NSC分化為多種類型的成熟神經(jīng)元、星狀細胞、少突膠質(zhì)細胞，修復(fù)、替代梗死后缺損的神經(jīng)細胞；(2)改變微環(huán)境，產(chǎn)生營養(yǎng)因子，如成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor)、表皮生長因子(epidermal growth factor)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor)等促進損傷修復(fù)作用的營養(yǎng)因子[16]；(3)減少了炎癥反應(yīng)的發(fā)生、抑制了膠質(zhì)細胞的增生，且促進了室管膜下區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖和遷移，整體提高了神經(jīng)細胞的修復(fù)能力；(4)通過促進血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor)和促血管生成素的生成，從而促進新生血管的形成，為神經(jīng)功能的恢復(fù)提供充足的血供[17]。實驗證據(jù)表明無腫瘤細胞形成。Oki等[8]人將在體外獲得的iPSC-NSC移植到腦梗死小鼠模型的紋狀體，10周后發(fā)現(xiàn)移植的細胞存活率是10%。Oki等人在10只裸鼠身上再次重復(fù)這個試驗，48 h后進行神經(jīng)干細胞的移植，4個月后發(fā)現(xiàn)細胞的存活率為50%，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)72%的細胞表達成熟神經(jīng)元抗體，6%的細胞表達星形膠質(zhì)細胞的抗體，2個月后2只小鼠死亡，8只存活，4個月后4只小鼠死亡，6只存活，所以移植后2個月的存活率為80%，4個月為60%；4個月后77%的細胞表達成熟神經(jīng)元抗體，5%的細胞表達紋狀體細胞的標(biāo)志物—多巴胺能和cAMP相關(guān)的神經(jīng)元磷蛋白(DARPP)-32，這個百分比與細胞直接移植到紋狀體后，存活的機率大致相同。這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示著進行移植的部位(例如皮層、紋狀體)不影響細胞最終的存活，而在體外將iPSCs分化為神經(jīng)干細胞再進行移植比直接使用iPSCs更能提高細胞的存活率。

目前iPSC的應(yīng)用存在最大的問題就是在基因整合的過程中腫瘤的發(fā)生，目前導(dǎo)致iPSC成瘤的因素還未明確。Riggs等[18]發(fā)現(xiàn)iPSCs與惡性肉瘤有部分細胞類型相同，在沉默基因與代謝活性方面存在某些共性，認為iPSC與癌細胞十分相似，腫瘤發(fā)生的原因可能就在于此。Park等[19]認為使用病毒作為載體將體細胞轉(zhuǎn)化為干細胞過程中會產(chǎn)生基因突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Mohammad等[20]用無病毒載體和無外源基因的編程方法誘導(dǎo)出iPSC，再將這些細胞分化成為神經(jīng)干細胞，并將這些細胞移植到腦梗死發(fā)生7 d后的實驗小鼠體內(nèi)，通過移除黏附物能力測試，測試到小鼠恢復(fù)了感知功能，且腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子也相應(yīng)的增加，從而促進細胞的存活、生長及突觸的形成，12個月后測試無腫瘤形成。為了去除iPSC中的致腫瘤基因，Liu等[21]也使用相同的方法在缺氧的條件下僅使用2個因子將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)染為iPSC，并將其誘導(dǎo)為神經(jīng)干細胞注入腦缺血小鼠模型，小鼠的神經(jīng)功能缺損也得到了改善，且無腫瘤形成。Thier等[22]使用最新的技術(shù)，成功地激活了Oct4將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化為iPSC，這種方法與傳統(tǒng)的iPSC技術(shù)相比生產(chǎn)速度提高了2～3倍，且細胞的致瘤性也得到了降低。有實驗表明當(dāng)移植宿主存在免疫缺陷時會增加致瘤的風(fēng)險[23]。

由于腦梗死的發(fā)病年齡老年化，因此Tatarishvili等[24]在24個月齡的大鼠身上完成了細胞移植治療腦梗死的實驗，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)干細胞移植8周后49%的細胞分化為成熟的γ氨基丁酸神經(jīng)元，圓筒實驗證明小鼠缺損的神經(jīng)功能明顯得到改善，且減少了小膠質(zhì)細胞的激活。目前大多數(shù)已發(fā)表的實驗都使用的是健康雄性鼠，將來還需要在雌性鼠及一些合并其他疾病的鼠身上開展實驗，如高血壓病、糖尿病等，這些都是腦梗死的危險因素[22]。

2 移植的時間窗和劑量

iPSC-NSC移植的重要問題之一就是腦梗死發(fā)生后細胞移植的時間，以往胚胎細胞移植的經(jīng)驗提示大腦中動脈閉塞致腦梗死發(fā)生后在第48 h移植細胞的存活率最高[25]，Shear等[26]認為腦梗死發(fā)生后第2～7 d為神經(jīng)干細胞移植的最佳時間，而非在這個時間點之前移植可能與急性期局部腦組織壞死、細胞釋放的炎癥介質(zhì)增高有關(guān)，且急性期的神經(jīng)營養(yǎng)因子較少，不利于細胞的生長，但是在腦梗死發(fā)生后第48 h這一時間點移植在臨床實施上比較困難，制備一定量的iPSC至少需要4周，再將其誘導(dǎo)為需要的神經(jīng)干細胞又需要幾周，而將這些細胞應(yīng)用于臨床前還需要經(jīng)過一系列的實驗，確保其安全性。因此，以現(xiàn)在的制備技術(shù)達到時間窗的要求還十分的困難。

目前就腦梗死細胞移植劑量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計還十分匱乏，大部分的數(shù)據(jù)主要來自鼠胚胎神經(jīng)干細胞的實驗，Darsila等[27]分別將3×105、7.5×105和15×105數(shù)量的神經(jīng)干細胞移植到腦梗死小鼠模型的腦內(nèi)，結(jié)果顯示當(dāng)移植細胞數(shù)超過3×105的時候，細胞的存活率將不再隨著細胞數(shù)的增加而增加，提示3×105數(shù)量的神經(jīng)干細胞可以以最小的數(shù)目發(fā)揮較好的治療效果。Wang等[28]認為8×105數(shù)量的神經(jīng)干細胞治療腦梗死的Wistar大鼠為最佳數(shù)目。此項實驗還沒有在與人類腦體積和構(gòu)造相似的大型動物身上實踐過，所以應(yīng)用人體的細胞數(shù)量可否依據(jù)這些實驗的細胞數(shù)據(jù)成比例計算還不明確。

3 展 望

目前對iPSC的定向誘導(dǎo)和神經(jīng)干細胞的移植治療腦梗死實驗研究已有很多，但還都停留在探索階段，以iPSC為基礎(chǔ)的細胞療法在治療腦梗死方面存在著巨大的潛力，但還有很多問題亟待明確，如iPSC的致瘤性、神經(jīng)干細胞移植的數(shù)量、時間、部位(缺血半暗帶內(nèi)還是梗死區(qū)域)。為了保證iPSC和NSC的質(zhì)量和減少制備時間，將來需要建立統(tǒng)一來源的iPSC細胞儲備庫，提供優(yōu)質(zhì)來源細胞，增加移植后的安全系數(shù)，使細胞移植治療腦梗死應(yīng)用于臨床早日實現(xiàn)。

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