雙藤痹痛凝膠膏劑對膠原誘導性關節(jié)炎模型大鼠血漿炎性因子和滑膜組織相關因子的影響

嚴國鴻++張玉琴++林雄++黃燕++翁淑琴++徐偉

摘要：目的 觀察雙藤痹痛凝膠膏劑對膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）模型大鼠血漿炎性細胞因子和滑膜組織Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）、核因子-κB（NF-κB）表達的影響，探討其相關作用機制。方法 大鼠尾部皮下注射膠原乳劑制作CIA模型。大鼠隨機分為正常組、模型組和雙藤痹痛凝膠高、低劑量組，ELISA檢測血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β及IL-6的含量，RT-PCR檢測滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表達，Western blot檢測滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表達。結果 與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠血漿TNF-α、IL-1β及IL-6含量顯著降低，滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表達明顯降低。結論 雙藤痹痛凝膠膏劑可能是通過抑制炎癥反應、調節(jié)滑膜組織TLR4/NF-κB信號通路相關靶點表達發(fā)揮抗炎作用。

關鍵詞：雙藤痹痛凝膠膏劑；膠原誘導性關節(jié)炎；Toll樣受體4；髓樣分化因子88；核因子-κB；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.010

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）01-0043-05

Effect of Shuangteng Bitong Cataplasm on Inflammatory Cytokines in Plasma and Relevant Factors of Rats with Collagen-induced Arthritis

YAN Guo-hong1， ZHANG Yu-qin2， LIN Xiong1， HUANG Yan1， WENG Shu-qin1， XU Wei2

1. Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 300122， China；

2. School of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350108， China

Abstract： Objective To study the effect of Shuangteng Bitong Cataplasm on TLR4， MyD88 and NF-κB and inflammatory cytokines in rats with collagen-induced arthritis； To discuss relevant mechanism of action. Methods A CIA model was made by subcutaneous injection of collagen emulsion from rat tail. Rats were randomly divided into normal group， model group， Shuangteng Bitong Cataplasm high-dose and low-dose groups. The contents of TNF-α， IL-1β and IL-6 in plasma were evaluated by ELISA， and the expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κB in synovial tissues were evaluated by RT-PCR and Western blot. Results Compared with the model group， the contents of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum decreased remarkably in the Shuangteng Bitong Cataplasm low-dose and high-dose group， and the expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κB in synovial tissues decreased remarkably. Conclusion Shuangteng Bitong Cataplasm can inhibit inflammatory reaction and regulate the expressions of relevant factors in synovial tissues to realize the anti-flammatory effects.

Keywords： Shuangteng Bitong Cataplasm； collagen-induced arthritis； TLR4； MyD88； NF-κB； rats

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以各關節(jié)病變?yōu)橹鳎瑫r伴多系統(tǒng)受累的慢性炎癥性的全身性自身免疫性疾病。其病理改變主要發(fā)生在關

基金項目：國家自然科學基金（81370096）；福建省科技廳引導性項目（2015Y0060）

通訊作者：徐偉，E-mail：xwfjlab@163.com

節(jié)，主要表現(xiàn)為關節(jié)腔積液、滑膜炎、炎癥細胞浸潤、微血管新生、血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞。目前RA的病因尚未完全闡明，一般認為是多因素誘發(fā)機體自身免疫反應而致病。Toll樣受體（TLRs）在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，能識別外源性病原相關分子模式及內源性分子產生的組織損傷、炎癥反應，通過跨膜結構將病原相關分子刺激信號轉導入細胞內，產生復雜的級聯(lián)信號反應，導致核因子-κB（NF-κB）等轉錄因子活化，介導白細胞介素（IL）-1、IL-6及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性介質基因的表達，引起相應炎癥介質的合成和釋放，進而趨化和激活嗜中性白細胞，活化淋巴細胞，啟動先天和獲得性免疫。TNF-α、IL-1及IL-6等是RA炎癥過程中主要的破壞性細胞因子，抑制TNF-α、IL-1及IL-6活性對控制RA病情進展有重要作用。雙藤痹痛凝膠膏劑是在福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院院內制劑雙藤痹痛酊的基礎上研制而成的新型制劑，前期動物實驗顯示，其具有抑制膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型大鼠的足趾腫脹、改善關節(jié)組織病理學變化、降低CIA大鼠關節(jié)炎指數(shù)的作用[1]。本實驗在前期研究的基礎上，從RA關節(jié)炎癥的重要信號傳導通路（TLR4/NF-κB信號通路）途徑入手，觀察雙藤痹痛凝膠膏劑對CIA大鼠血漿炎性因子及滑膜組織相關因子的影響，探討其相關作用機制。endprint

1 實驗材料

1.1 動物

雄性Wistar大鼠40只，SPF級，鼠齡10～12周齡，體質量（220±20）g，上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2007-0005。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，光暗周期12 h/12 h，溫度（25.0±0.5）℃，相對濕度50%～70%，大鼠適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 藥物

雙藤痹痛凝膠膏劑（由雷公藤、青風藤、穿山龍、甘草等組成，每貼8 cm×12 cm，含雷公藤甲素 246.59 μg，含青藤堿155.89 mg），福建中醫(yī)藥大學藥學院，批號20140310；空白凝膠膏劑（NP700、卡波姆等水溶性高分子材料），福建中醫(yī)藥大學藥學院，批號20140310-1。

1.3 主要試劑與儀器

完全弗氏佐劑（CFA）、不完全弗氏佐劑（IFA）、牛Ⅱ型膠原，美國Chondrex公司；TLR4、髓樣分化因子88（MyD88）和NF-κB一抗，Cell Signaling Technology；Trizol試劑（Invitrogen），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒（Fermentas），DreamTaqTM Green PCR Master Mix（2X）試劑盒（Fermentas）。CS-1EAS型電子天平（北京市菲姆斯科技開發(fā)公司），TD5A-WS臺式低速離心機（湘儀離心機儀器有限公司），C1000TM Thermal cycler PCR儀（美國Bio-RAD公司），ChemiDocTM XRS+核酸成像系統(tǒng)（美國Bio-RAD公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

參考文獻[2-3]方法建立CIA模型。將牛Ⅱ型膠原（2 mg/mL）與CFA等體積混合，研磨制成膠原乳劑。于大鼠尾部2 cm處皮下注射膠原乳劑0.2 mL/只，并于第7日在大鼠尾部3 cm處皮下注射牛Ⅱ型膠原與IFA等體積的混合乳液0.1 mL/只，進行2次免疫。將關節(jié)炎指數(shù)評分>1的大鼠納入實驗。

2.2 關節(jié)炎指數(shù)測定

大鼠初次免疫后第4日開始（每隔3 d）觀察大鼠四肢關節(jié)病變程度。病變程度按0～4級評分法[1]評分，四肢關節(jié)炎指數(shù)之和代表每只大鼠關節(jié)炎指數(shù)，積分越高，關節(jié)癥狀越嚴重，最高分值為16分。評分標準：0分，關節(jié)正常無紅腫；1分，趾關節(jié)紅腫；2分，趾關節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關節(jié)在內的全部足爪腫脹、關節(jié)嚴重變形。

2.3 分組及給藥

除正常組外，動物初次注射膠原乳劑后第2日開始，將雙藤痹痛凝膠膏劑貼于大鼠背部固定，每日1次（同一部位），連續(xù)28 d。其中模型組為空白凝膠膏劑，大小2 cm×3 cm；雙藤痹痛高、低劑量組分別給予3 cm×3 cm、1 cm×3 cm的雙藤痹痛凝膠膏劑。

2.4 血漿與滑膜組織的采集與處理

大鼠于最后一次給藥后，腹腔注射10%水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，腹主動脈取血，收集大鼠新鮮血液約6 mL，室溫靜置1 h，3000 r/min離心15 min，將上清液移至Eppendorf管分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

處死大鼠后取右膝關節(jié)，沿膝關節(jié)正中縱行切開皮膚，直至暴露以膝關節(jié)為中心約0.3 cm×0.3 cm 的區(qū)域，以有齒鑷提起髕骨。沿髕骨上緣向下切割直至股骨，再分別沿髕骨兩側向下分離至脛骨，此時即打開了膝關節(jié)腔，可見由髕骨下緣向上有一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織，用刀片完全剝離滑膜組織，并完整取下，投入液氮中保存，供指標檢測。

2.5 ELISA檢測血漿腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β和白細胞介素-6含量

取適量血漿樣本溶解后，根據(jù)TNF-α、IL-1β及IL-6試劑盒說明書的實驗步驟加入樣品、酶標偶合液、顯色劑室溫孵育，反應完全后加入終止液，于酶標儀波長450 nm處測定每孔的吸光度。

2.6 RT-PCR檢測滑膜組織Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子-κB的mRNA表達

采用Trizol兩步法提取每只大鼠滑膜組織總RNA，每組10只。取總RNA 1 μg反轉錄成cDNA。反應體系20 μL，擴增條件為：95 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像分析系統(tǒng)進行觀察及光密度掃描，以GAPDH基因為內參，各基因擴增條帶的光密度值與各自內參的光密度值之比作為評價指標。引物序列見表1。

2.7 Western blot檢測滑膜組織Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子-κB的蛋白表達

滑膜組織加入RIPA裂解液后勻漿，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法檢測其蛋白濃度，20 μL上樣，經SDS-PAGE電泳分離，電轉至固相支持體PVDF膜上，分別加入一抗和二抗，發(fā)光試劑發(fā)光，成像。應用Bio-Rad軟件對Western雜交蛋白區(qū)帶進行積分光密度值分析。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 一般變化

初次免疫1周后大鼠關節(jié)無紅腫，活動無明顯異常狀態(tài)出現(xiàn)。隨著時間的延長，造模組大鼠活動和進食量減少，毛發(fā)干枯，精神萎靡；后足趾關節(jié)開始出現(xiàn)紅腫，逐步蔓延到尾部，少數(shù)可累及前肢，并且日趨嚴重，關節(jié)功能活動障礙，不能正常行走；雙藤痹痛高、低劑量組大鼠上述癥狀明顯緩解，且背部連續(xù)給藥28 d未發(fā)現(xiàn)過敏反應及皮損現(xiàn)象。endprint

4.2 雙藤痹痛凝膠膏劑對模型大鼠關節(jié)炎指數(shù)的影響

初次免疫后模型組大鼠各時點關節(jié)炎指數(shù)明顯升高；與模型組比較，第12日后雙藤痹痛低劑量組大鼠關節(jié)炎指數(shù)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。

4.3 雙藤痹痛凝膠膏劑對模型大鼠血漿腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β和白細胞介素-6含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血漿TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，雙藤痹痛高劑量組大鼠血漿TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯降低（P<0.01），雙藤痹痛低劑量組大鼠血漿IL-1β和IL-6含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），結果見表3。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

4.4 雙藤痹痛凝膠膏劑對模型大鼠滑膜組織Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子-κB mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，雙藤痹痛高劑量組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88、NF-кB mRNA表達顯著降低（P<0.01），雙藤痹痛低劑量組大鼠滑膜組織TLR4、NF-кB mRNA表達顯著降低（P<0.05，P<0.01），結果見圖1。

4.5 雙藤痹痛凝膠膏劑對模型大鼠滑膜組織Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子-κB蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白高度表達（P<0.01），陽性表達條帶清晰；與模型組比較，雙藤痹痛高劑量組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達顯著降低（P<0.01），雙藤痹痛低劑量組大鼠滑膜組織MyD88、NF-κB蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結果見圖2。

圖2 各組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達

5 討論

TLRs在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，能識別外源性病原相關分子模式及內源性分子產生的組織損傷、炎癥反應，通過跨膜結構將病原相關分子刺激信號轉導入細胞內，產生復雜的級聯(lián)信號反應，導致NF-κB等轉錄因子活化，介導IL-1、IL-6及TNF-α等炎性介質基因的表達，引起相應炎癥介質的合成和釋放，進而趨化和激活中性粒細胞，活化淋巴細胞，啟動先天和獲得性免疫；內源性TLR配體被稱為損傷相關分子模式，包括活化細胞和壞死細胞釋放的內源性分子及細胞外基質分子。多項研究表明，TLRs信號通路與RA的發(fā)病機理關系密切[4-5]。

NF-κB是一種常見的轉錄因子，炎癥反應的核心調控因子。NF-κB由2類亞基形成同源或異源二聚體，最常見的亞基組成形式為p65/p50或p65/p65。正常情況下，細胞內外通路正、負反饋對NF-κB的活化精細調節(jié)使NF-κB的活化在適當水平[6]。NF-κB未被激活時分布在細胞漿中，可以被炎癥因子（IL-1β、TNF-α等）、生長因子或趨化因子等激活，通過1個或多個信號途徑使抑制性蛋白I-κB磷酸化、泛素化并進一步降解，使NF-κB與I-κB解離，移位至胞核，與DNA上啟動子區(qū)域相應的靶基因位點結合，進而啟動一系列免疫相關基因如前炎癥介質（如IL-1β、TNF-α、IL-6等）及一些炎性相關酶類的轉錄程序，導致其表達增多，使大量炎性細胞浸潤于炎癥部位，從而引起或進一步加重體內炎癥反應[7-8]。

有研究表明，NF-κB能促進滑膜細胞的增殖并抑制其凋亡，導致滑膜增生肥厚，加重關節(jié)組織結構的破壞[9]。RA患者滑膜組織NF-κB p65表達及活化水平均顯著高于正常對照組，IL-1β mRNA表達水平也高于正常組，并與NF-κB的活化水平呈正相關[10]。另有研究顯示，牛Ⅱ型膠原所致的CIA模型大鼠關節(jié)滑膜的NF-κB p65蛋白表達明顯高于正常對照組[11]。本研究結果表明，雙藤痹痛凝膠膏劑在一定劑量下可降低CIA大鼠血漿TNF-α、IL-1β及IL-6水平，降低CIA大鼠滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB的表達，提示雙藤痹痛凝膠膏劑可能通過抑制炎癥反應、調節(jié)滑膜組織TLR4/NF-κB信號通路相關靶點蛋白表達發(fā)揮抗炎作用。

已有研究表明，雷公藤內酯醇[12]、青藤堿[13]、穿山龍總皂苷[14]等均可抑制大鼠滑膜細胞增殖。雙藤痹痛凝膠膏劑是由多味中藥組成，含有成分較多，其作用機制可能與這些成分有關，有待今后進一步研究。

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（收稿日期：2017-06-19）

（修回日期：2017-07-24；編輯：華強）endprint