運(yùn)動訓(xùn)練對心臟衰老的保護(hù)機(jī)制

陶麗嬋,賈 方

心力衰竭是一個典型的與心臟老化有關(guān)的疾病,其流行率和發(fā)病率均隨著年齡的增長而急劇增加[1].老化所致的心臟結(jié)構(gòu)重塑主要包括心肌細(xì)胞的丟失、剩余心肌細(xì)胞的反應(yīng)性肥大以及心肌纖維化[2-3].心肌細(xì)胞的丟失主要是通過凋亡,而線粒體相關(guān)的凋亡途徑被認(rèn)為是最關(guān)鍵的調(diào)控老化相關(guān)凋亡的通路[4].研究認(rèn)為,對于70歲男性而言,由于心臟老化,約30%的心肌細(xì)胞會丟失[4-5].

越來越多的研究表明,運(yùn)動訓(xùn)練對心血管具有保護(hù)作用,主要體現(xiàn)在減少心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險,促進(jìn)生理性心臟生長,提高抗氧化能力和線粒體穩(wěn)定性[6-7].過氧化物酶體增殖物激活受體 γ輔激活因子 (peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α,PGC-1α)和蛋白激酶B(Akt)的信號通路的激活對運(yùn)動介導(dǎo)的心臟保護(hù)具有重要的意義[8].已有研究表明,運(yùn)動訓(xùn)練是老年人心臟康復(fù)有效的手段[9].但是,目前運(yùn)動訓(xùn)練抵抗心臟衰老的機(jī)制還有待完善.本研究通過在衰老模型小鼠中引入運(yùn)動訓(xùn)練,明確運(yùn)動訓(xùn)練是否能通過線粒體復(fù)制,線粒體代謝以及DNA損傷等方式保護(hù)心臟衰老.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

無特定病原體(specif i c pathogen free,SPF)級雄性C57BL/6小鼠,8～10周,所有操作均依照美國國立衛(wèi)生院(National Institutes of Health)的相關(guān)規(guī)定.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

小鼠跑臺、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀、熒光定量PCR儀.

1.1.3 材料

D-gal(D-galactosamine)購于Sigma公司.PCR相關(guān)試劑:Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green,購于Takara公司.384孔PCR板購于Roche公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物實(shí)驗(yàn)方案

8～10周的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組:對照組(n=6),D-gal注射組(n=6),D-gal注射+運(yùn)動組(n=6).D-gal注射組按照100 mg/(kg·d)的劑量皮下注射4個月,對照組則注射等量的生理鹽水.D-gal注射+運(yùn)動組的處理方式為在注射D-gal的同時按照10 m/min速度連續(xù)運(yùn)動訓(xùn)練4個月,每天運(yùn)動1 h.

1.2.2 熒光定量PCR

利用Trizol提取小鼠心臟組織的核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),取1μg的總RNA,加入5倍的逆轉(zhuǎn)錄試劑2μL,利焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水將總體積補(bǔ)充到10μL,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDAN),用于檢測基因信使RNA(messenger ribonucleic acid,mRNA)水平的表達(dá).利用合成的cDNA和特異性的PCR引物檢測目標(biāo)mRNA的表達(dá),擴(kuò)增的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)產(chǎn)物以SYBR Green標(biāo)記,采用18S作為內(nèi)參基因,以2?ΔΔCT的方法進(jìn)行目標(biāo)基因相對表達(dá)量的計(jì)算.本研究采用的實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)引物序列如表1所示.

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)均采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,選用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,并以Bonferroni作兩兩比較,其中p＜0.050表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Sequences of the primers for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 心功能損傷

采用熒光定量PCR檢測心鈉素(atrial natriuretic peptide,ANP)的表達(dá),注射D-gal后小鼠心肌中ANP的mRNA的表達(dá)水平如圖1所示,其中**表示p＜0.010,n=6.由圖1可以看出,與對照組相比,注射D-gal組ANP的表達(dá)量明顯升高,而注射D-gal+運(yùn)動組的ANP表達(dá)水平降低.

圖1 注射D-gal后小鼠心肌中ANP的表達(dá)水平Fig.1 Expression of ANP in the mouse myocardium after hypodermic injection of D-gal

2.2 線粒體生成

采用熒光定量PCR分別檢測小鼠心臟組織中線粒體DNA(mitochondrion DNA,mtDNA)復(fù)制相關(guān)的基因(POLG,SSBP1,TWINKLE和TOP1MT)和由線粒體DNA編碼的參與能量代謝的基因(ND1,ND2,ND6,COX1,COX2,16S,ATPase6和Cytb),結(jié)果如圖2和3表示,其中*表示p＜0.050,**表示p＜0.010,***表示p＜0.001,n=6.由圖2可以看出,在與線粒體復(fù)制相關(guān)的基因中,與對照組相比,D-gal組中POLG,TWINKLE和TOP1MT的表達(dá)量明顯降低,而進(jìn)行跑步訓(xùn)練后POLG,TWINKLE,TOP1MT和SSBP1的表達(dá)水平明顯升高.由圖3可以看出,在線粒體DNA編碼的參與能量代謝的基因中,D-gal注射組中ND1,ND6,COX1,COX2,16S和Cytb的表達(dá)量明顯降低,而進(jìn)行跑步訓(xùn)練后ND1,ND2,ND6,COX1,COX2,16S,ATPase6和Cytb的表達(dá)水平均升高.

圖2 注射D-gal后小鼠心肌中線粒體DNA復(fù)制相關(guān)基因的表達(dá)水平Fig.2 Expression of mtDNA replication-related genes in the mouse myocardium after hypodermic injection of D-gal

2.3 PGC-1α 和PGC-1β

采用熒光定量PCR檢測小鼠心肌中能量代謝相關(guān)的PGC-1α和PGC-1β的表達(dá)量,結(jié)果如圖4所示,其中*表示p＜0.050,**表示p＜0.010,***表示p＜0.001,n=6.由圖4可以發(fā)現(xiàn),在注射D-gal導(dǎo)致心臟衰老組中,PGC-1α和PGC-1β的表達(dá)水平明顯降低,但同時加入跑步訓(xùn)練后,PGC-1α和PGC-1β的表達(dá)量則明顯升高.

圖3 注射D-gal后小鼠心肌中線粒體DNA編碼的基因的表達(dá)水平Fig.3 Expression of mtDNA encoded genes in the mouse myocardium after hypodermic injection of D-gal

圖4 注射D-gal后小鼠心肌中PGC-1α和PGC-1β的表達(dá)水平Fig.4 Expression of PGC-1α和PGC-1β in the mouse myocardium after hypodermic injection of D-gal

2.4 減少DNA損傷

采用熒光定量PCR檢測小鼠心臟DNA損傷相關(guān)的基因,結(jié)果如圖5所示,其中*表示p＜0.05,**表示p＜0.01,n=6.由圖5可以看出,注射D-gal后,ATR的表達(dá)明顯降低,而同時添加跑步后,ATR和ATM的表達(dá)水平明顯升高.

3 討論

越來越多的研究表明,衰老可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變.這些由于衰老而導(dǎo)致的心功能的退化,也許是老年人更易于患各種心血管疾病的主要原因[10].基于此,本研究采用D-gal誘導(dǎo)小鼠衰老模型.D-gal是一種生理性營養(yǎng)物質(zhì),使用過量會導(dǎo)致代謝的異常,主要會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),隨之引發(fā)一系列的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷和基因表達(dá)異常等[11].D-gal慢性處理動物引起的加速衰老是目前老年病學(xué)可靠的模型建立方式.D-gal處理引發(fā)動物壽命減短,表現(xiàn)出正常衰老的一些特征[12].本研究發(fā)現(xiàn):處理D-gal小鼠表現(xiàn)為ANP表達(dá)升高,這表明衰老后,小鼠心臟受損,心功能異常;而運(yùn)動使得衰老小鼠ANP的表達(dá)量降低,這表明運(yùn)動對于衰老后的心功能具有保護(hù)作用.

圖5 注射D-gal后小鼠心肌中ATR和ATM的表達(dá)水平Fig.5 Expression of ATR和ATM in the mouse myocardium after hypodermic injection of D-gal

衰老往往與線粒體功能的降低相關(guān),主要表現(xiàn)在氧化磷酸化水平降低,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合成能力減弱,線粒體DNA突變增加,線粒體結(jié)構(gòu)異常,氧化自由基增多[13].本研究首先發(fā)現(xiàn)了在D-gal所致的衰老心肌中,線粒體復(fù)制相關(guān)基因(POLG,SSBP1,TWINKLE和TOP1MT)和編碼的基因(ND1,ND2,ND6,COX1,COX2,16S,ATPase6和Cytb)表達(dá)量出現(xiàn)降低的情況,而運(yùn)動訓(xùn)練后這些基因的表達(dá)恢復(fù)甚至高于正常不運(yùn)動的小鼠.這表明,運(yùn)動對線粒體數(shù)量和功能的維持甚至是促進(jìn)具有十分重要的意義.同時,從PGC-1α介導(dǎo)的能量代謝來看,D-gal所致的衰老心肌中PGC-1α和PGC-1β表達(dá)量降低,表明能量代謝能力降低,而運(yùn)動訓(xùn)練后表達(dá)水平的顯著升高表明能量代謝能力的恢復(fù).這部分結(jié)果揭示出,運(yùn)動訓(xùn)練可以通過保護(hù)線粒體的數(shù)量、功能以及代謝能力達(dá)到心肌保護(hù)的作用.此外,在D-gal注射組的小鼠中ATR的表達(dá)下降,而運(yùn)動訓(xùn)練后ATR和ATM的表達(dá)升高,表明運(yùn)動訓(xùn)練對抗DNA損傷具有促進(jìn)意義.

總之,本研究表明長時間的運(yùn)動訓(xùn)練對于心臟衰老具有保護(hù)作用,具體是通過促進(jìn)線粒體的生成,維持線粒體的功能和激活PGC-1α途徑來實(shí)現(xiàn).這為心臟康復(fù)提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療策略.

[1]STRAIT J B,LAkATTA E G.Aging-associated cardiovascular changes and their relationship to heart failure[J].Heart Failure Clinics,2012,8(1):143-164.

[2]MISAkA T,SUZUkI S,MIYATA M,et al.Def i ciency of senescence marker protein 30 exacerbates angiotensinⅡ-induced cardiac remodelling[J].Cardiovascular Research,2013,99(3):461-470.

[3]KWAk H B.Aging,exercise,and extracellular matrix in the heart[J].Journal of Exercise Rehabilitation,2013,9(3):338-347.

[4]KWAk H B.Eあects of aging and exercise training on apoptosis in the heart[J].Journal of Exercise Rehabilitation,2013,9(2):212-219.

[5]BERGMANN O,BHARDWAj R D,BERNARD S,et al.Evidence for cardiomyocyte renewal in humans[J].Science,2009,324(5923):98-102.

[6]WEINER R B,BAGGISH A L.Exercise-induced cardiac remodeling[J].Progress in Cardiovascular Diseases,2012,54(5):380-386.

[7]ELLISON G M,WARING C D,VICINANZA C,et al.Physiological cardiac remodelling in response to endurance exercise training:cellular and molecular mechanisms[J].Heart,2012,98(1):5-10.

[8]MANN N,ROSENZWEIG A.Can exercise teach us how to treat heart disease?[J].Circulation,2012,126(22):2625-2635.

[9]LAI C H,HO T J,KUO W W,et al.Exercise training enhanced SIRT1 longevity signaling replaces the IGF1 survival pathway to attenuate aging-induced rat heart apoptosis[J].AGE,2014,36(5):9706-9709.

[10]OZTURk N,OLGAR Y,ER H,et al.Swimming exercise reverses aging-related contractile abnormalities of female heart by improving structural alterations[J].Cardiology Journal,2017,24(1):85-93.

[11]KUMAR A,DOGRA S,PRAkASH A.Eあect of carvedilol on behavioral,mitochondrial dysfunction,and oxidative damage against D-galactose induced senescence in mice[J].Naunyn Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology,2009,380(5):431-441.

[12]WANG W,LI S,DONG H P,et al.Diあerential impairment of spatial and nonspatial cognition in a mouse model of brain aging[J].Life Sciences,2009,85(3/4):127-135.

[13]ZHANG Y,MI S L,HU N,et al.Mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 accentuates aginginduced cardiac remodeling and contractile dysfunction:role of AMPK,Sirt1,and mitochondrial function[J].Free Radical Biology&Medicine,2014,71:208-220.