千佛菌含藥血清對H22小鼠肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

胥 冰，張麗君，郭小蘭，石小玲

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046）

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑

藥材為陜西鎮(zhèn)安縣千佛菌種植基地千佛菌；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Sigma）；二甲基亞楓（DMSO，Sigma）；RPMI1640培養(yǎng)液（Hyclone）；胎牛血清。

1.2 主要儀器

5%CO2培養(yǎng)箱（BindCD-150），超凈工作臺（蘇州安泰），倒置熒光數(shù)碼顯微鏡NikonTS-100F（DS-5MC），精密電子天平（德國賽多利斯股份公司），流式細(xì)胞儀（BD，美國），二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（BINDER C150）。

1.3 實驗動物、瘤株

SD大鼠20只，體質(zhì)量（250±5）g，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK（陜）2007-001。小鼠H22肝癌細(xì)胞株，我校免疫室贈予。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備及滅活

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為4組（n=4）：空白組；模型組；含藥血清大、小劑量組。含藥血清組，取500 g千佛菌加水大火煮沸轉(zhuǎn)文火煎煮120 min，此法煎煮2次，合并兩次濾液并濃縮至0.5 L相當(dāng)于1 g/mL生藥量為原液，以原液為大劑量即100%濃度；生理鹽水倍比稀釋后為小劑量即50%濃度2.5 g/（kg·次）灌胃給藥，2次/d?？瞻捉M，給予同劑量生理鹽水[3]。連續(xù)7 d，末次灌胃2 h后，麻醉，采血，無菌分離血清，56℃，30 min滅活處理，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 MTT法檢測千佛菌含藥血清對H22細(xì)胞增殖的影響

從液氮中取出H22細(xì)胞株復(fù)蘇。用含10% FBS 的1640培養(yǎng)基在37℃含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，至對數(shù)生長期，將其制備成密度為3×106/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL?？瞻捉M加入1640培養(yǎng)液，含藥血清大劑量組加入100 μL100%含藥血清；含藥血清小劑量組：加入100 μL100%含藥血清，對照組：加入100 μL正常大鼠血清。每組設(shè)3個平行孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72h后，每孔加入5 mg/mL的MTT10 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄掉上清，每孔加入150 ul DMSO，振蕩10 min，待結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度（A），計算抑制率。生長抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測H22細(xì)胞凋亡

據(jù)MTT實驗結(jié)果最終選定各組在48 h為最佳作用時間，將培養(yǎng)24 h的H22細(xì)胞，取兩瓶，分別加入大小劑量含藥血清，作用48 h，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，75%冰乙醇固定，避光加入碘化丙啶（PI）染液混勻30 min，流式細(xì)胞儀檢測，計數(shù)10000個細(xì)胞，檢測凋亡率，實驗重復(fù)3次，取均值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 千佛菌含藥血清對小鼠H22肝癌細(xì)胞增殖的影響

大、小劑量千佛菌含藥血清均對H22肝癌細(xì)胞的增殖有抑制作用 ，但大劑量更為明顯。抑制率呈明顯的時間-劑量依賴性，充分說明千佛菌能夠抑制腫瘤的增殖。

3.2 流式細(xì)胞儀檢測小鼠H22肝癌細(xì)胞凋亡

將不同劑量千佛菌含藥血清加入H22肝癌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，千佛菌含藥血清大、小劑量均能誘導(dǎo)H22肝癌細(xì)胞凋亡，而以大劑量組作用更顯著。與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。

4 討 論

千佛菌是一種藥、食兼用的珍稀食用真菌。主要含多糖、維生素、蛋白質(zhì)以及微量元素等，其主要活性成分及抗腫瘤成分為灰樹花多糖，千佛菌具有“扶正固本”之功效。為祖國醫(yī)學(xué)之扶正固本藥，能增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，改善癥狀，延長生存期，提高生活質(zhì)量。本次實驗，我們通過制備千佛菌大鼠含藥血清，體外干預(yù)小鼠H22肝癌細(xì)胞24、48、72h發(fā)現(xiàn)均對H22肝癌細(xì)胞有一定的抑制增殖作用，且大劑量藥效最好。

綜上所述，本研究通過體外實驗，驗證了千佛菌含藥血清對小鼠H22肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，證實了千佛菌對H22細(xì)胞有較好的抑制作用，為臨床篩選抗腫瘤藥物，尤其為開發(fā)天然的低毒或無毒藥物提供了理論及實驗依據(jù)，也為腫瘤疾病的臨床治療提供了新思路、新方法。