細(xì)胞因子調(diào)控肌腱干細(xì)胞分化方向的研究進(jìn)展

陳計(jì)穩(wěn)，鄭小飛，王華軍

(暨南大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院∥暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)與運(yùn)動醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 510630)

肌腱損傷是危害生活質(zhì)量的常見病，隨著老齡化社會程度的加重和體育運(yùn)動的普及其發(fā)病率不斷增長[1-3].研究顯示，在50至80歲以上人群中，肩袖損傷的發(fā)病率從23%逐步升高至65%[4].在芬蘭跟腱損傷的發(fā)病率由1979年的每10萬人群2.1人增加到2011年的每10萬人群21.5人，33年間上升了9倍多[5].高發(fā)病率的肌腱損傷也給患者及社會帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān).僅肩袖損傷在美國每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就超過70億美元[6].雖然肌腱損傷的治療技術(shù)逐步提高[7-8]，各種藥物及修復(fù)材料不斷更新，但由于肌腱損傷后再生能力較弱，存在瘢痕增生和肌腱粘連等因素，其生物力學(xué)性能往往只能達(dá)到正常肌腱的40%.因此，肌腱損傷后如何獲得良好的再生及滿意的功能恢復(fù)是目前亟待解決的臨床難題.肌腱干細(xì)胞(tendon derived stem cells, TDSCs)具有腱系分化的潛能，自從2007年被發(fā)現(xiàn)以來，已有動物實(shí)驗(yàn)證明局部注射肌TDSCs能夠顯著促進(jìn)肌腱損傷愈合[9].此外，TDSCs在組織工程生物支架的應(yīng)用上也具有良好的前景[10].隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)由于TDSCs具有多向分化的生物學(xué)特性，除了腱系分化外，還包括成脂分化、成軟骨分化、成骨分化，而且其影響因素十分復(fù)雜，如何在體內(nèi)誘導(dǎo)TDSCs定向分化是TDSCs發(fā)揮臨床療效的關(guān)鍵.細(xì)胞因子(cytokine，CK)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生成代謝、細(xì)胞免疫反應(yīng)以及修復(fù)等生物學(xué)作用，是體內(nèi)生理病理反應(yīng)的重要調(diào)控因子.目前相關(guān)研究已經(jīng)證明細(xì)胞因子對TDSCs的分化方向也具有重要的調(diào)節(jié)作用[11]，本文就細(xì)胞因子影響TDSCs分化方向及相關(guān)機(jī)制展開探討.

1 轉(zhuǎn)化生長因子-β(transform growth factor, TGF-β)

TGF-β是機(jī)體生長發(fā)育、損傷修復(fù)的重要調(diào)節(jié)因子.目前研究證實(shí)TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3這3種亞型都參與了TDSCs的分化過程，在肌腱形成和損傷修復(fù)中起著重要作用[12].GUO J等[13]將從大鼠跟腱分離培養(yǎng)獲得的TDSCs在質(zhì)量濃度為10 ng/mL TGF-β1條件下，培養(yǎng)10 d后分別檢測肌腱細(xì)胞標(biāo)志物Col1a1、Dcn和Fmod及主要的腱系轉(zhuǎn)錄因子 Scx、Egr1和Eya1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組以上標(biāo)志物的表達(dá)顯著高于對照組，表明在TGF-β1的誘導(dǎo)下TDSCs向肌腱細(xì)胞分化的能力明顯增強(qiáng).然而隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度不同的TGF-β1對TDSCs的分化方向產(chǎn)生不同的作用.Holladay[14]分別使用質(zhì)量濃度為1、10、100 ng/mL TGF-β1與TDSCs共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 ng/mL質(zhì)量濃度組的骨粘連蛋白(osteonectin)表達(dá)上調(diào)，硫酸氨基葡萄糖染色呈陽性，證明該組TDSCs成軟骨樣分化.隨著質(zhì)量濃度的升高SCX、TEN-C、1型和2型膠原蛋白的表達(dá)上調(diào)，顯示TDSCs成肌腱細(xì)胞分化.TGF-β3在TDSCs分化中的作用也與作用時(shí)間及質(zhì)量濃度相關(guān).郭宇鵬等[15]將大鼠跟腱TDSCs分別在不同質(zhì)量濃度TGF-β3(5.0、2.5、1.0、0 ng/mL)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，分別于第1、3、5天收集細(xì)胞進(jìn)行成腱、成脂、成軟骨及成骨分化的基因標(biāo)志物表達(dá)的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在短時(shí)間、低質(zhì)量濃度TGF-β3培養(yǎng)會誘導(dǎo)TDSCs向腱系分化，而高質(zhì)量濃度、長時(shí)間刺激則向成骨或成軟骨方向分化.由此可見TGF-β3的具體作用與其質(zhì)量濃度和處理時(shí)間存在著交互作用，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究.TGF-β2也具有調(diào)控TDSCs腱系分化的作用.研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)TGF-β2受到抑制時(shí)，肌腱纖維排列松散不規(guī)則，纖維間隙明顯增大，1型膠原、Thbs 4和細(xì)胞外基質(zhì)生成均顯著減少.當(dāng)TGF-β2表達(dá)增加時(shí)，肌腱纖維排列規(guī)則、緊密，TDSCs腱系分化標(biāo)志物Scx、Mkx和I、III型膠原也明顯增加.進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)miR-378 a可以作為TGF-β2的上游調(diào)控其表達(dá)[16].由此可見，TGF-β各個(gè)亞型對TDSCs分化方向的作用各不相同，并且受質(zhì)量濃度的影響.在干細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化時(shí)可以根據(jù)分化方向的需要選擇不同的TGF-β亞型和質(zhì)量濃度，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究.

2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)

BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子家族，目前與TDSCs分化相關(guān)的BMP亞型主要有BMP-2、BMP-12.Rui[17]將大鼠TDSCs在含有BMP-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d和一周后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中與鈣結(jié)節(jié)結(jié)合的茜素紅含量顯著高于對照組，提示BMP-2促進(jìn)TDSCs成骨分化；在培養(yǎng)第14天時(shí)成脂分化標(biāo)志物C/EBP和pPARγ的mRNA表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組顯著增加，表明BMP-2在兩周時(shí)促進(jìn)TDSCs成脂分化；而在培養(yǎng)第21天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組HE染色顯示細(xì)胞顆粒中可見肥大的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞，并且細(xì)胞中Sox9、PG以及細(xì)胞外基質(zhì)中II型膠原的表達(dá)均顯著增高，證實(shí)TDSCs在BMP-2培養(yǎng)3周時(shí)向成軟骨方向分化；而在所有時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組TDSCs中腱系分化標(biāo)志物Col1a1、scx和tnmd的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低，證明BMP-2具有抑制TDSCs腱系分化的作用.BMP-2這一調(diào)控作用也在國內(nèi)學(xué)者的研究中得到證實(shí)[18].由此可見BMP-2對TDSCs的調(diào)控呈時(shí)間依賴性.與BMP-2的作用相反，BMP-12則表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)TDSCs腱系分化的作用.XU K[19]分別將BMP-12與結(jié)締組織生長因子(CTGF)共同轉(zhuǎn)染的TDSCs、單純BMP-12或CTGF轉(zhuǎn)染的TDSCs、以及未被BMP及CTGF轉(zhuǎn)染的TDSCs移植入大鼠髕腱損傷模型中，結(jié)果顯示BMP-12和CTGF共轉(zhuǎn)染的TDSCs組大鼠髕腱在移植術(shù)后第2周及第8周愈合顯著優(yōu)于其他3組，該組髕腱的生物力學(xué)及組織學(xué)結(jié)果均接近正常髕腱.同時(shí)成腱分化基因 I/III型膠原, 肌腱蛋白C(tenascin-C)和 scleraxis表達(dá)均上升，而成脂、成軟骨及成骨分化基因表達(dá)的標(biāo)志物明顯下調(diào)，證明了BMP-12可協(xié)同CTGF促進(jìn)TDSCs向腱系分化的作用.因此，BMP-12作為誘導(dǎo)TDSCs腱系分化的細(xì)胞因子可用于肌腱修復(fù)的研究，但其需要與CTGF等生長因子共同作用才能起到良好的腱系分化作用.

3 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factot，bFGF)

bFGF也是調(diào)控TDSCs分化的重要因子.大量動物實(shí)驗(yàn)顯示肌腱在損傷后，損傷處的肌腱細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長因子的表達(dá)明顯上調(diào)，加速成纖維細(xì)胞的增殖，最終促進(jìn)了損傷的愈合.盛加根等[20]利用雞制作第3指屈肌腱切斷模型，A組使用纖維蛋白封閉劑(fibrin sealant，F(xiàn)S)處理，B組用500 ng bFGF與FS混合物0.6 μL處理，C組為對照組做單純縫合.結(jié)果顯示在術(shù)后4周及8周時(shí)bFGF與FS混合物治療組的肌腱生物力學(xué)明顯優(yōu)于其他兩組，病理切片顯示該組肌腱及腱周膠原含量也明顯增高，證明bFGF可以有效地促進(jìn)肌腱損傷后的愈合.另外，Oryan[21]用bFGF治療兔淺屈肌腱損傷也證明其在促進(jìn)肌腱損傷愈合的應(yīng)用價(jià)值.隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)bFGF是通過促進(jìn)TDSCs腱系分化而治療肌腱損傷的.Tokunaga[22]在大鼠肩袖損傷模型中使用bFGF混合明膠處理肩袖損傷端，結(jié)果在第6周和第12周實(shí)驗(yàn)組的大鼠肩袖最大拉力顯著優(yōu)于對照組，TDSCs中PCNA、Scx、Tnmd、Sox9等基因表達(dá)均明顯上調(diào)，這提示bFGF促進(jìn)了肌腱干細(xì)胞的腱系分化.隨后Vigano[23]在體外研究中將TDSCs與bFGF共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在肌腱干細(xì)胞減少的同時(shí)，肌腱細(xì)胞的數(shù)量不斷增加，該研究也證明了bFGF誘導(dǎo)TDSCs的腱系分化作用.因此，bFGF是誘導(dǎo)TDSCs鍵系分化的重要細(xì)胞因子，但目前研究多為局限于動物實(shí)驗(yàn)，其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究.

4 白細(xì)胞介素(interleukin, IL)

IL是體內(nèi)重要的一類細(xì)胞因子，具有傳遞信息，激活和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的作用.在介導(dǎo)細(xì)胞活化、增殖與分化中也起重要作用.近年來，研究發(fā)現(xiàn)其還可調(diào)控TDSCs分化.目前的研究主要涉及IL-1、IL-6和IL-10.Zhang[24]將小鼠跟腱損傷部位的TDSCs在不同質(zhì)量濃度IL-1β(1、5、10 ng/mL)中培養(yǎng)，結(jié)果顯示培養(yǎng)7 d后所有質(zhì)量濃度的IL-1β組TDSCs中的膠原蛋白I/III、二聚糖、纖維調(diào)節(jié)素、早期反應(yīng)發(fā)生蛋白和肌腱細(xì)胞標(biāo)志物SCX、腱調(diào)蛋白的表達(dá)比對照組均顯著下調(diào)，證明其對TDSCs腱系分化的抑制作用.另外還發(fā)現(xiàn)成脂標(biāo)志物Cebpa和Cebpg，成軟骨標(biāo)志物Agg和SOX9，成骨標(biāo)志物Osx和Runx2等均受到抑制，表明IL-1β同時(shí)抑制TDSCs成脂、成軟骨及成骨分化.并且IL-1β對TDSCs分化的抑制作用是不可逆的，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基去除IL-1β后，這種抑制作用依然持續(xù)存在.另外IL-6對TDSCs的腱系分化也有抑制作用.Chen[25]將正常的大鼠跟腱TDSCs在不同質(zhì)量濃度的IL-6環(huán)境下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6促進(jìn)TDSCs從細(xì)胞周期的G1期到G2/M期轉(zhuǎn)變，極大的增強(qiáng)了TDSCs的增殖能力，然而實(shí)驗(yàn)組的肌腱細(xì)胞標(biāo)志物(Scx、膠原蛋白I/III和腱調(diào)蛋白)的表達(dá)均被顯著地抑制，證明了其腱系分化受到明顯的抑制.國內(nèi)學(xué)者陳思偉[26]也做了類似研究，同樣證實(shí)了IL-6抑制TDSCs成腱分化，還進(jìn)一步證明IL-6對TDSCs腱系分化的抑制作用是通過Jak/STAT3信號通路實(shí)現(xiàn)的.多項(xiàng)研究還探討IL-10對TDSCs腱系分化的影響.Deng[27]將TDSCs與不同質(zhì)量濃度IL-10(0.1、1、10、100 ng/mL)培養(yǎng)3 d，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組TDSCs Scx、Col1、Tnmd、Col3 mRNA的表達(dá)水平較對照組顯著下降，而且IL-10高質(zhì)量濃度組(10、100 ng/mL)比低質(zhì)量濃度組(0.1、1 ng/mL)下降更明顯.由此可見，目前研究發(fā)現(xiàn)的各種白細(xì)胞介素都對TDSCs的腱系分化起到抑制作用，甚至對其他方向的分化也存在抑制作用.但白細(xì)胞介素家族成員眾多，其他因子的具體作用還需進(jìn)一步研究.

5 結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)

CTGF是一個(gè)富含半胱氨酸的分泌肽，是對結(jié)締組織細(xì)胞有促分裂和化學(xué)趨化活性的生長因子，還具有促細(xì)胞增殖、遷移及分化等作用，與包括血管、皮膚、心臟、腎臟、胰腺、肺及肝臟等在內(nèi)的許多組織器官纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).近年來研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其在TDSCs分化過程中也起到一定的調(diào)控作用.Lui等[28]在大鼠髕腱損傷模型中分別采用經(jīng)CTGF處理過的TDSCs、未處理的TDSCs移植于髕腱損傷處，并與對照組進(jìn)行對比研究，8周后通過組織學(xué)、超聲影像學(xué)、以及生物力學(xué)測定對比發(fā)現(xiàn)，采用TDSCs移植的兩組肌腱纖維排列及肌腱橫截面積甚至優(yōu)于未移植TDSCs的對照組16周時(shí)的愈合程度，而經(jīng)過CTGF處理的肌腱愈合情況顯著優(yōu)于未經(jīng)CTGF處理組，從而證明CTGF能夠促進(jìn)損傷肌腱的愈合.隨后，竇海波等[29]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)大鼠跟腱TDSCs經(jīng)CTGF培養(yǎng)14 d后，I型膠原和腱生蛋白C(Tenascin-C)等成纖維細(xì)胞蛋白標(biāo)志物的mRNA和蛋白的含量均比對照組顯著升高，這就證明在CTGF的誘導(dǎo)下，TDSCs有效地向肌腱成腱性分化.Liu等[30]的研究也證明CTGF可以調(diào)控TDSCs腱系分化，進(jìn)而促進(jìn)肌腱愈合的作用，還進(jìn)一步證明CTGF是通過Smad 1/5/8信號通路促進(jìn)TDSCs成腱分化的作用機(jī)制.目前，關(guān)于CTGF調(diào)控TDSCs分化的研究較少，還需進(jìn)一步的深入研究.

6 其他細(xì)胞因子

胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors, IGF-1)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、早期生長反應(yīng)因子(early growth response factor, EGR-1)、前列腺素E2(prostaglandin, PGE2)、P物質(zhì)(P substance, SP)等其他細(xì)胞因子也具有調(diào)控TDSCs分化的作用.LIU J等[31]研究發(fā)現(xiàn)將IGF-1與BMP-2共同培養(yǎng)TDSCs時(shí)，成脂分化標(biāo)志物PPARγ的表達(dá)明顯提高，脂肪細(xì)胞數(shù)量也顯著增加，其作用優(yōu)于兩種因子單獨(dú)使用，表明 IGF-1與 BMP-2可協(xié)同誘導(dǎo)TDSCs成脂分化.該研究還進(jìn)一步證明其是通過激活CREB與 Smad介導(dǎo)PGE2來促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的成脂分化的.HGF能夠抑制TDSCs的成骨分化.在Han等[32]的研究中將大鼠TDSCs與不同質(zhì)量濃度的HGF共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)HGF質(zhì)量濃度在 10～40 ng/mL范圍時(shí)，TDSCs成骨標(biāo)志物基因Col1A1、Alp和Runx2的表達(dá)受到抑制，而質(zhì)量濃度在40～80 ng/mL范圍時(shí)這些成骨標(biāo)志物的表達(dá)并沒有隨著質(zhì)量濃度的升高進(jìn)一步下降，這表明HGF具有抑制TDSCs成骨分化的作用，其抑制作用并未隨質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng).EGR-1也是TDSCs分化的重要調(diào)節(jié)因子.國內(nèi)學(xué)者陶旭[33]從基因轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白表達(dá)等方面證實(shí)高表達(dá)的EGR-1可以促進(jìn)TDSCs向腱系分化，同時(shí)成軟骨、成骨及成脂分化均受到抑制，隨后進(jìn)一步證實(shí)EGR-1是通過BMP-12/Smad1/5/8信號通路促進(jìn)TDSCs向腱系分化的.PGE2在TDSCs的分化過程中也起一定的作用.Liu[31]將大鼠TDSCs與不同質(zhì)量濃度PGE2(10、50、100、200 ng/mL)共同培養(yǎng)7 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成脂分化標(biāo)志物PPARγ的表達(dá)隨時(shí)間及PGE2質(zhì)量濃度的增加而增加，而當(dāng)PGE2質(zhì)量濃度達(dá)到100 ng/mL及作用時(shí)間超過7 d后不再增加.這表明PGE2誘導(dǎo)TDSCs成脂分化，并在一定程度內(nèi)與濃度質(zhì)量和時(shí)間成正相關(guān).另外也有研究發(fā)現(xiàn)SP作為重要的促炎癥反應(yīng)介質(zhì)，通過其受體NK-1R促進(jìn)TDSCs成脂肪和成軟骨分化.周游[34]對比研究了低劑量SP組和高劑量SP組對大鼠跟腱TDSCs的作用.第14及28天取大鼠跟腱標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)兩組的成脂分化標(biāo)志物PPARγ及成軟骨分化標(biāo)志物ColⅡ的表達(dá)均明顯增高，并且高劑量組的表達(dá)高于低劑量組.

綜上所述，TDSCs是治療肌腱損傷的有力工具，但如何在體內(nèi)誘導(dǎo)TDSCs定向分化是肌腱干細(xì)胞發(fā)揮臨床療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié).目前研究已經(jīng)證明多種細(xì)胞因子可以調(diào)控其分化方向，部分機(jī)制已被闡明，但由于影響因素十分復(fù)雜，很多細(xì)胞因子的作用還未完全闡明，尤其在體內(nèi)常常是多種因子共同作用，因此還需進(jìn)一步深入研究，為TDSCs的臨床應(yīng)用尋求合適的方案.