外泌體在胰腺疾病診療中的應(yīng)用

外泌體是由多種活體細(xì)胞分泌的囊泡小體，其中含有蛋白質(zhì)和RNA等多種成分，直徑大多介于40～150 nm之間。外泌體作為蛋白質(zhì)、核酸以及脂類物質(zhì)的運(yùn)輸及存儲(chǔ)工具，存在于血液、尿液、唾液及腹水等體液中，囊內(nèi)成分由于囊泡的保護(hù)而不被降解，可作用于較遠(yuǎn)的細(xì)胞或組織，廣泛參與多種疾病的病理生理學(xué)過程。近年研究表明，急性胰腺炎(AP)患者外周血中外泌體含量顯著升高，且胰腺癌(PC)患者循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞來源的外泌體水平亦明顯升高，并在上述胰腺疾病的病程演進(jìn)中發(fā)揮重要的生物學(xué)調(diào)控作用，已成為胰腺領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)[1-2]。而慢性胰腺炎(CP)的反復(fù)發(fā)作和轉(zhuǎn)歸也與外泌體生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮密切相關(guān)。本文對外泌體在胰腺疾病發(fā)生發(fā)展中作用的最新研究作一綜述。

一、外泌體概述

外泌體內(nèi)含有大量特異性的蛋白質(zhì)和核酸(DNA、mRNA和miRNA等),還有脂類(膽固醇和神經(jīng)酰胺等)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(膜連蛋白、Rab27和SNAP25等)、分子伴侶 (Hsp70和Hsp90等)、抗原遞呈相關(guān)的大量組織特異性蛋白、整合素類、四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82等)和主要組織相容性復(fù)合體(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)等[3-13]。外泌體表面的特異性標(biāo)志物主要有CD63、CD81、CD9、TSG101和HSP27等。

目前，外泌體的提取方法主要有差速離心法、超速離心法、過濾離心法、密度梯度離心法、免疫磁珠法和色譜法，而鑒定方法則主要包括透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)、蛋白質(zhì)印跡法和流式細(xì)胞術(shù)。外泌體的常規(guī)儲(chǔ)存條件為-80℃，重復(fù)的冷凍和融化會(huì)影響囊泡的完整性[14]。外泌體分離鑒定后，可結(jié)合芯片和二代測序結(jié)果篩選與疾病相關(guān)的差異表達(dá)因子，并最終分析其可能參與的生物學(xué)功能及信號通路。近年來，調(diào)控外泌體釋放和發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的信號通路仍不明確，考慮其與病毒在大小、密度、組成及功能等方面的相似性，故可借鑒病毒的相關(guān)成果來開展外泌體的系列性創(chuàng)新研究[15]。

二、外泌體與AP

近年研究表明，外泌體在AP時(shí)巨噬細(xì)胞的募集和活化方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。胰腺腺泡細(xì)胞分泌的外泌體可促進(jìn)不相鄰器官間巨噬細(xì)胞的互相激活，同時(shí)巨噬細(xì)胞釋放的外泌體亦可促進(jìn)毗鄰或遠(yuǎn)處的細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。AP發(fā)病早期，局部受損的胰腺腺泡細(xì)胞通常釋放大量的促炎遞質(zhì)來相繼激活位于胰腺組織、腹膜、肺臟、肝臟及消化道中的巨噬細(xì)胞。機(jī)體大量激活的巨噬細(xì)胞可通過“扳機(jī)”樣作用進(jìn)一步釋放大量的促炎細(xì)胞因子，從而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征。Bonjoch等[1]在大鼠AP模型中發(fā)現(xiàn),外周血中外泌體的含量顯著增加；當(dāng)觀察被熒光染料標(biāo)記的外泌體時(shí)，發(fā)現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)中的外泌體可有效到達(dá)肺泡組織且被肺泡巨噬細(xì)胞攝取，證實(shí)來源于AP模型循環(huán)系統(tǒng)中的外泌體可激活肺泡巨噬細(xì)胞，繼而加重AP引發(fā)的肺損傷程度。

AP病程中，外泌體在胰腺組織間液pH值的變化中也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。部分外泌體依靠本身的V-ATPase(一種細(xì)胞膜上的質(zhì)子泵)主動(dòng)提高囊泡內(nèi)H+的濃度，導(dǎo)致組織液酸化，進(jìn)而對周圍組織造成一定的損傷[16]。

研究表明，AP血漿中可鑒別的外泌體大部分來源于肝臟和機(jī)體免疫細(xì)胞，部分來源于腎臟和消化道。需要注意的是，肝臟可攝取大量胰腺來源的外泌體并導(dǎo)致胰腺外泌體的標(biāo)志性蛋白含量升高不明顯甚至下降[1]。目前，外泌體在AP中的相關(guān)報(bào)道仍然較少。筆者認(rèn)為，今后的研究方向可主要集中在：(1)如何降低循環(huán)系統(tǒng)中的外泌體至正常水平；(2)如何有效抑制其產(chǎn)生、釋放過程；(3)如何準(zhǔn)確抑制其與靶細(xì)胞的相互作用。

三、外泌體對PC發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控作用

PC是惡性程度較高的消化系統(tǒng)實(shí)體腫瘤，外泌體在此領(lǐng)域中的研究主要集中在PC侵襲轉(zhuǎn)移、早期診斷、藥物治療和耐藥等方面。外泌體在腫瘤進(jìn)展過程中的不同方面均發(fā)揮重要作用，是PC早期發(fā)現(xiàn)、轉(zhuǎn)移預(yù)測和預(yù)后評估的重要生物標(biāo)記物。

Costa-Silva等[2]首次在小鼠PC模型中發(fā)現(xiàn)，胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)來源的外泌體可誘導(dǎo)肝臟轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。近年來，外泌體促進(jìn)PC轉(zhuǎn)移方面的研究主要包括以下5個(gè)方面：(1)破壞正常細(xì)胞間的緊密連接，增加血管通透性[10]；(2)在同種細(xì)胞或不同類型細(xì)胞間傳輸致癌能力，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性[17]；(3)促進(jìn)上皮-間質(zhì)間的轉(zhuǎn)變[18-19]；(4)腫瘤源性外泌體通過對遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行改造及刺激血管再生，進(jìn)而促進(jìn)適宜循環(huán)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處定植的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[20-21]；(5)影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝[22]。以上多種機(jī)制提示，腫瘤來源的外泌體可作為一種新型的預(yù)測PC轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)記。

外泌體攜帶的DNA、miRNA、長鏈非編碼RNA、蛋白質(zhì)和其膜上的抗原等均具有組織和細(xì)胞特異性，因此可作為PC的早期診斷標(biāo)志物[13,23]。在體液中分離出PC來源的外泌體(tumor cell-derived exosomes,TEX)，并分析其中攜帶的特異性生物標(biāo)志物，有望成為一種早期無創(chuàng)的腫瘤診斷與監(jiān)測的有效方法。研究表明，在小鼠PDAC模型中，血漿外泌體中的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子(MIF)含量在胰腺上皮內(nèi)瘤變階段已顯著增高，且從PDACⅠ級患者血漿中已經(jīng)可以檢測到外泌體MIF的存在[2]。在PC和乳腺癌患者血清外泌體中均可以檢測到磷脂酰肌醇聚糖-1(GPC-1)的存在，且GPC-1在早、晚期PC均可檢測到表達(dá)增高，而健康人群血清外泌體GPC-1的表達(dá)則處于較低水平。此外，GPC-1還可用于PC與胰腺良性疾病(如CP)的鑒別。Melo等[24]研究表明，GPC-1在PC來源的外泌體中可被檢測到，且血漿中GPC-1的檢測敏感性和特異性均為100%，而對能檢測到MIF的PDACⅠ型患者則同樣適用。外泌體中 GPC-1和MIF的聯(lián)合檢測將是PC早期診斷中極具吸引力且無創(chuàng)的檢測方法。Que等[25]研究發(fā)現(xiàn),PC患者血漿中外泌體miRNA-17-5p和miR-21呈高表達(dá)狀態(tài)，并指出miRNA-17-5p可作為預(yù)測PC進(jìn)展的有效指標(biāo)。

吉西他濱是PC較為有效的化療藥物，但腫瘤細(xì)胞在其長期應(yīng)用后可出現(xiàn)耐藥性。吉西他濱的長期應(yīng)用會(huì)增加PC細(xì)胞miR-155的表達(dá)，而外泌體在miR-155的分泌中則發(fā)揮重要的調(diào)控作用，進(jìn)而可能參與了對吉西他濱耐藥的形成過程[26]。腫瘤成纖維細(xì)胞(PDAC腫瘤團(tuán)塊主要細(xì)胞類型)在PC耐藥發(fā)生過程中也發(fā)揮了重要作用。Richards等[27]使用吉西他濱治療1例PDAC后發(fā)現(xiàn)，腫瘤成纖維細(xì)胞釋放的外泌體量明顯增加，且這些外泌體可增加腫瘤上皮細(xì)胞中耐藥誘導(dǎo)因子的含量，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并增加耐藥的發(fā)生率。

目前，PC的最新治療措施包括單克隆抗體靶向治療和抗腫瘤血管生成藥物的使用等。外泌體參與腫瘤治療時(shí)，可直接以外泌體作為治療媒介，也可通過以阻斷外泌體介導(dǎo)的耐藥為目標(biāo)，方法包括：(1)腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可通過呈遞抗原，引起特異性免疫排斥反應(yīng)。(2)可作為基因治療的載體，具有能透過血腦屏障、低毒性及組織相容性高等特點(diǎn)。外泌體miRNA可通過改變細(xì)胞周期調(diào)控以及誘發(fā)抗凋亡程序來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞由耐藥表型向敏感型轉(zhuǎn)變；外泌體亦可有助于小干擾RNA(siRNA)跨越細(xì)胞膜。(3)阻斷外泌體釋放過程，抑制外泌體與靶細(xì)胞的相互作用。

四、外泌體與CP

胰腺組織纖維化已被公認(rèn)為各種原因所致CP的共同病理學(xué)特征，亦是CP病程演進(jìn)的核心事件及防治的關(guān)鍵靶點(diǎn)。目前，外泌體在胰腺組織纖維化中發(fā)揮的作用已逐漸成為CP領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。面對CP發(fā)病的各種高危因素，處于休眠狀態(tài)的胰腺星狀細(xì)胞(PSC)在形態(tài)和功能上開始向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，且產(chǎn)生并堆積較多的膠原蛋白，而以上過程可被連接組織生長因子(CCN2)調(diào)控。CCN2可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的功能，包括黏附、遷移、增生、分化、衰老和凋亡等。在胰腺組織中，CCN2可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育時(shí)β細(xì)胞的復(fù)制,并可在胰腺炎時(shí)刺激PSC的纖維化進(jìn)程，從而調(diào)節(jié)PDAC上皮和間質(zhì)成分的比例。Charrier等[28]研究發(fā)現(xiàn)，CP病程中CCN2在活化型PSC中的表達(dá)較靜止型PSC中明顯上調(diào)，且CCN2和miR-21在PSC中存在正反饋環(huán)路。CCN2和miR-21都存在于PSC分泌的大小介于50～150 nm間的CD9+囊泡中，也即外泌體中。用綠色熒光蛋白標(biāo)記攜帶CCN2和miR-21的外泌體，可被其他PSC攝取。CCN2和miR-21在PSC間的轉(zhuǎn)運(yùn)可使其促進(jìn)胰腺組織纖維化的作用明顯增強(qiáng)?？梢姡钄嗤饷隗w在PSC間的轉(zhuǎn)運(yùn)，可能會(huì)對CP具有一定的治療作用。

目前為止，隨著外泌體在胰腺疾病中重要作用的不斷被發(fā)現(xiàn)，其相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究亦在不斷展開。外泌體作為胞外囊泡的一種，與不同胞外囊泡的直徑范圍相互重疊，且具有相似的發(fā)生機(jī)制和細(xì)胞膜標(biāo)志物，因此嚴(yán)格分離不同微泡極其困難。對于外泌體的提取，始終沒有一種有效的純化方法能夠同時(shí)兼顧其含量、純度和生物活性，缺乏有效的純化方法是外泌體能否在臨床廣泛應(yīng)用所面臨的主要挑戰(zhàn)。明確外泌體的生理學(xué)功能對于確定其在胰腺疾病中生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮至關(guān)重要，有關(guān)外泌體來源、合成和生物學(xué)功能的研究仍需大量開展。近年來，外泌體的相關(guān)研究多集中在胰腺疾病的早期診斷、PC轉(zhuǎn)移和耐藥等方面，關(guān)于建立外泌體介導(dǎo)的藥物投遞系統(tǒng)和消除外泌體介導(dǎo)的PC轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究尚有不足。在胰腺疾病發(fā)生發(fā)展的不同階段，外泌體扮演了不同的角色，而關(guān)于外泌體的研究則應(yīng)該從多模式、多角度進(jìn)行。