流式細胞術在獸醫(yī)臨床上的應用研究

余娟 徐彥召 劉興友

摘要 本文介紹了流式細胞術的工作原理，闡述了流式細胞術近年來在獸醫(yī)病毒感染診斷、寄生蟲診斷、微量元素檢測3個方面的臨床應用研究，并展望了流式細胞術在畜禽疾病診斷和預防方面的應用前景，以期為流式細胞術在獸醫(yī)臨床上的應用提供參考。

關鍵詞 流式細胞術；病毒感染；寄生蟲診斷；微量元素

中圖分類號 R446 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）21-0239-02

Application Research of Flow Cytometry in Veterinary Clinic

YU Juan 1 XU Yan-zhao 1 LIU Xing-you 2 *

（1 Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang Henan 453003； 2 Xinxiang University）

Abstract This paper introduced the working principle of flow cytometry，expounded the application research of flow cytometry in veterinary virus infection，parasites diagnosis，trace element detection，and its application prospect in livestock and poultry disease diagnosis and prevention were prospected，in order to provide references for the application of flow cytometry in veterinary clinic.

Key words flow cytometry；virus infection；parasites diagnosis；trace element detection

流式細胞術是一種現(xiàn)代細胞檢測技術，即利用流式細胞儀對懸浮于流體中的細胞或其他生物微粒進行理化特征分析、計數(shù)和分選[1]。早期主要應用于醫(yī)學領域中的腫瘤學和血液學研究，近年來，隨著免疫學、生物化學、微生物學、分子生物學等學科的迅猛發(fā)展、相互滲透和交叉，已應用到細菌、真菌和病毒的快速檢測及微生物群落結構領域。此外，這一技術不僅應用于科研、教學等不同領域的研究，而且為畜牧生產(chǎn)等領域提供了強有力的工具。

1 工作原理

流式細胞術檢測的對象是細胞，并且是懸浮于液體中、呈獨立狀態(tài)的細胞。在一定壓力下，鞘液帶著懸浮的細胞進入流式照射室，特定波長的激光束直接照射到細胞后發(fā)生散射和折射，發(fā)射出散射光，細胞上結合的熒光素被激光激發(fā)后產(chǎn)生熒光，不同顏色的熒光被雙色反光鏡轉向不同的光電倍增管檢測器，轉換成電信號，被相應的接收器接收后放大，再經(jīng)過數(shù)據(jù)化處理輸入電腦并儲存，從而分析出每個細胞的物理化學特征。

2 在獸醫(yī)臨床上的應用研究

2.1 病毒感染診斷方面

流式細胞術是一種簡便、快速分析待測細胞的種類、亞類及其功能等特性的技術，最早應用于人醫(yī)免疫檢測，近年來已廣泛應用于免疫細胞表面標志及細胞內細胞因子檢測等方面[2]。淋巴細胞亞群（如CD3、CD4和CD8）和表型分析在免疫功能檢測中具有重要的意義，特別是隨著近年來免疫學研究的快速發(fā)展，淋巴細胞亞群和表型分析也廣泛應用于獸醫(yī)臨床研究。CD3分子與T細胞抗原受體（TCR）通過非共價鍵連接，形成TCR_CD3復合物，TCR識別抗原后，通過CD3傳導刺激信號，在體外可產(chǎn)生多種細胞因子，從而誘導細胞毒作用，增強T細胞、LAK細胞和NK細胞的殺傷力。CD4分子主要分布在淋巴細胞和胸腺細胞表面，有黏附、細胞間信號傳導和HIV受體等功能[3]。CD8分子是細胞間黏附分子，也分布于淋巴細胞和胸腺細胞的表面，具有信號傳導作用。

在獸醫(yī)臨床上，檢測淋巴細胞亞群的表達數(shù)量及比值的變化對疾病預防及治療進程的監(jiān)測具有重要意義[4]。李 華等[5]利用流式細胞術通過檢測SPF仔豬感染PRRS病毒后BJ-4外周血淋巴細胞亞群的動態(tài)，得出淋巴細胞各亞群的比例下降，抑制了機體對病原體的免疫反應，這些比值變化也揭示了其他病原體的混合感染或繼發(fā)感染。司興奎等[6]利用流式細胞術對豬前腔靜脈血中的CD4/CD8進行檢測，研究了豬圓環(huán)病毒2型感染對偽狂犬疫苗免疫應答的影響，結果表明，PCV2感染在一定程度上影響了機體T細胞和B細胞對抗原的識別功能，抑制了機體特異性細胞免疫，這一研究對臨床PR疫苗免疫具有重要意義。齊 偉[7]以流式細胞術為基礎，對REV感染的SPF雛雞免疫器官中淋巴細胞周期分布及CD4+、CD8+T淋巴細胞數(shù)量及比值變化進行檢測，研究了REV感染對SPF雛雞免疫器官的免疫功能的影響，為RE的防治提供了理論基礎。鄒 璐等[8]對不同日齡仔豬外周血T淋巴細胞進行檢測與分析，建立了健康仔豬外周血淋巴細胞亞群的臨床參考范圍，為不同生長階段仔豬的免疫系統(tǒng)功能水平監(jiān)測奠定了基礎。通過對畜禽淋巴細胞各亞群的數(shù)量和比值變化測定來監(jiān)控畜禽的免疫狀態(tài)，監(jiān)控畜禽病毒傳染性疾病，能制定更有效的預防治療措施。

2.2 寄生蟲診斷方面

畜禽寄生蟲病感染宿主在臨床上多處于非清除性免疫狀態(tài)，寄生蟲種類多，分布廣泛，重復感染機會很多，嚴重影響動物的身體健康，損害其繁殖性能，抑制幼年動物的生長發(fā)育，極大地削弱了其生產(chǎn)性能，導致畜產(chǎn)品的數(shù)量和質量降低。

近年來，隨著流式細胞儀的推廣應用，利用流式細胞術在寄生蟲感染診斷方面的研究應用也較廣。崔 洋等[9]利用流式細胞術檢測了約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟巨噬細胞后膜分子CD36和CD64的變化動態(tài)，結果表明，隨著感染時間的延長，CD36和CD64表達水平逐漸升高至峰值，并通過吞噬方式殺傷瘧原蟲，此研究證明巨噬細胞是小鼠發(fā)揮抗瘧原蟲感染的保護性效應細胞。周永華等[10]應用流式細胞術對弓形蟲感染后大鼠外周血T細胞亞群的變化進行檢測，結果表明，機體在抗弓形蟲感染免疫中，T細胞亞群產(chǎn)生了大量的細胞因子，在抗弓形蟲感染中起著重要的作用。徐 鵬等[11]運用流式細胞術對仔豬人工感染豬囊尾蚴蟲后外周血中淋巴細胞亞群的動態(tài)變化進行了研究，通過對CD3+T、CD4+T和CD8+T細胞數(shù)量的檢測，客觀地反映了機體細胞免疫狀況。利用流式細胞術從細胞水平上檢測寄生蟲感染后淋巴細胞亞群及相關細胞因子的變化，對寄生蟲病的預防控制與早期治療具有重要意義，已應用于多種寄生蟲感染的輔助檢查，可以較快獲知感染時期、感染程度等。

2.3 微量元素檢測方面

微量元素是動物體必需的營養(yǎng)元素，直接參與機體幾乎所有的生理、生化活動，對動物的新陳代謝、生長發(fā)育及生產(chǎn)性能影響較大。因此，在畜禽日糧中微量元素的添加日益受到關注。由于對飼料中微量元素含量及其利用率缺乏系統(tǒng)準確的分析，生產(chǎn)中微量元素添加存在盲目性，且添加量普遍過高[12]。過量的微量元素大部分隨排泄物進入環(huán)境，造成環(huán)境污染。

研究微量元素日糧對畜禽生產(chǎn)性能的影響，對提高微量元素的利用率、減少排放和控制環(huán)境污染具有重要意義。崔恒敏等[13]利用流式細胞術研究了銅添加量對雛雞淋巴細胞凋亡的影響，結果表明，日糧銅含量超過400 mg/kg，活性淋巴細胞數(shù)量減少，導致機體免疫功能受損。龔 濤等[14]研究了高氟日糧對雛雞肝細胞周期和凋亡的影響，流式細胞術試驗結果顯示，日糧含氟400 mg/kg時，對雛雞肝臟生長發(fā)育無顯著影響；但是日糧含氟800、1 200 mg/kg時，能增強肝細胞增殖能力，使凋亡細胞顯著增多。陳 濤等[15]用流式細胞術研究了高氟日糧對雛雞法氏囊淋巴細胞增殖分化的影響發(fā)現(xiàn)，日糧含氟400 mg/kg時，對雛雞法氏囊生長發(fā)育無顯著影響；而日糧含氟800、1200 mg/kg時，會引起法氏囊淋巴細胞增殖分化受阻，法氏囊生長發(fā)育受抑，凋亡細胞顯著增多，機體體液免疫功能受損。崔 偉等[16]用流式細胞術研究了高銅對雛鴨腎臟細胞周期和凋亡的影響，結果表明，日糧添加銅達到400 mg/kg以上時，腎臟細胞增殖分化嚴重受阻，腎臟細胞凋亡大量增加，導致腎臟功能嚴重受損。彭西[17]利用流式細胞術研究日糧硒對雛雞免疫功能影響的機理發(fā)現(xiàn)，日糧硒水平達到5 mg/kg以上會導致免疫器官細胞分裂增殖能力下降、凋亡細胞增多；外周血T淋巴細胞增殖能力降低，CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞數(shù)量下降，進而導致免疫器官生長發(fā)育受阻，出現(xiàn)病理損傷，嚴重影響其生長發(fā)育。

微量元素作為多種酶的構成成分和活性成分，同時也是動物體內免疫因子之一，從消化、吸收、利用各個層次調控動物體內能量、蛋白質等的代謝過程，并調控機體內分泌、調節(jié)體內離子平衡和滲透壓，調節(jié)機體神經(jīng)體液機制和免疫反應等，對動物健康至關重要[18-19]?？茖W合理添加日糧中微量元素的含量不僅能提高畜禽的生產(chǎn)性能，而且可以減少微量元素的濫用排放，降低養(yǎng)殖業(yè)對環(huán)境的污染。

3 展望

流式細胞術是對單細胞進行定量分析和分選的一門檢測技術，具有分析快速[20-21]、檢測指標多、數(shù)據(jù)量大、應用范圍廣等優(yōu)點。流式細胞術在細胞生物學、免疫學、腫瘤學、血液學等領域的研究中已得到廣泛應用。近年來，隨著各新型流式細胞儀的開發(fā)，各熒光染料的充分發(fā)展，流式細胞術在畜禽疾病診斷方面的研究也較為普遍，為畜牧養(yǎng)殖業(yè)提供了重要的診斷依據(jù)[22-25]。隨著流式細胞儀小型化、操作簡單化的發(fā)展，流式細胞術在畜禽疾病診斷和預防方面將有更廣闊的應用前景。

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