中藥清毒栓對宮頸癌SiHa細胞產(chǎn)生免疫相關(guān)細胞因子的影響

樓姣英+金哲+李洋

[摘要] 目的 探討中藥清毒栓含藥血清對宮頸癌SiHa細胞產(chǎn)生免疫相關(guān)細胞因子的影響。方法 選取SPF級SD大鼠雌性30只[體重（220±10）g]，分成兩組，分別用純凈水和中藥灌胃處理后抽血提取含藥血清，設(shè)立空白對照組（0%含藥大鼠血清）、清毒栓低、中、高劑量組（濃度分別為1%、4%、8%含藥大鼠血清），采用q-PCR法檢測細胞IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ的基因表達情況，采用Western Blot法檢測SiHa細胞內(nèi)IL-8、TNF-α的蛋白表達情況。結(jié)果 不同劑量的清毒栓含藥血清在12 h、24 h、48 h對宮頸癌SiHa細胞免疫相關(guān)細胞因子的基因表達均有一定促進表達作用，其中以IL-8、TNF-α在8%濃度含藥血清給藥后12～24 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P<0.05）；細胞內(nèi)IL-8、TNF-α蛋白表達量在高劑量組給藥后48 h呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。結(jié)論 高劑量清毒栓含藥血清可顯著誘導(dǎo)免疫相關(guān)細胞因子IL-8、TNF-α基因的表達，并能夠使細胞內(nèi)IL-8、TNF-α蛋白的表達量增加，其作用機制可能是通過促進相關(guān)基因的表達量來增加相應(yīng)細胞因子蛋白的表達。

[關(guān)鍵詞] 免疫相關(guān)細胞因子；SiHa細胞；中藥清毒栓；含藥血清

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）30-0033-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of traditional Chinese medicine Qingdu suppository-containing serum on immune-related cytokines in SiHa cells of cervical cancer. Methods SPF grade SD rats（body weight of 220±10）g were selected， with 30 female rats， which were divided into two groups. The drug-containing serum was collected by blood drawing after the treatment of pure water and Chinese medicine gavage respectively. The blank control group （0% drug-containing rat serum）， low， medium and high dose group of Qingdu suppository （concentrations of 1%， 4%， 8% of drug-containing rat serum） were set. The gene expression of IL-2， IL-8， TNF-α and IFN-γ was detected by q-PCR method， and the protein expression of IL-8 and TNF-α within SiHa cells was detected by Western Blot method. Results Different doses of Qingdu suppository-containing serum all showed a certain effect of expression promotion on the gene expression of immune-related cytokines in SiHa cells of cervical cancer at 12 h， 24 h， 48 h. The level of IL-8 and TNF-α was in a significantly increasing trend within 12 to 24 hours after the administration of 8% drug-containing serum（P<0.05）； the protein expression volume of IL-8 and TNF-α in the cells was in a significantly increasing trend within 48 hours after the administration in the high-dose group. Conclusion The Qingdu suppository-containing serum in the high dose group can significantly induce the gene expression of immune-related cytokines IL-8 and TNF-α， and can increase the expression volume of intracellular IL-8 and TNF-α protein. Its mechanism may be by promoting the expression volume of related genes to increase the expression of the corresponding cytokine protein.

[Key words] Immune-related cytokines； SiHa cells； Chinese medicine Qingdu suppository； Drug-containing serum

宮頸癌在女性癌癥中位居第二位，其發(fā)病率有逐年升高趨勢，目前已經(jīng)明確人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌的首要病因[1]。在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，HPV感染后的細胞免疫功能下降是一個重要因素，導(dǎo)致病毒在體內(nèi)持續(xù)存在并向腫瘤發(fā)展。臨床研究已經(jīng)證實中藥清毒栓具有消除HPV的作用[2-4]，前期的實驗研究結(jié)果也顯示，中藥清毒栓可通過多種途徑參與抗腫瘤作用[5-12]。細胞免疫因子IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ是影響細胞免疫功能的重要因素?；谝郧暗难芯?，我們推測中藥清毒栓可以通過促進相關(guān)免疫因子基因的表達，進而增加相應(yīng)細胞因子蛋白的表達來起抗腫瘤作用。本研究以宮頸癌SiHa細胞為研究對象，探討中藥清毒栓對宮頸癌SiHa細胞免疫因子基因及蛋白表達量的影響，從分子水平上探討中藥在宮頸癌細胞中抗腫瘤的機制。endprint

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組 選取SD雌性大鼠30只，體重為（220±10）g。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[京動許字（2000）第004號總049號]。隨機分成空白血清組中藥清毒栓組，每組15只。

SiHa細胞培養(yǎng)分組：陰性對照組（不加血清，即正常對照組）、空白對照組（加空白血清，即0%含藥大鼠血清）、清毒栓低、中、高劑量組（濃度分別為1%、4%、8%含藥大鼠血清）。每組各5例。

1.1.2藥物與試劑 中藥清毒栓（主要由莪術(shù)30 g、黃柏15 g、紫草15 g、金銀花15 g等組成），將復(fù)方藥物分別醇提（紫草）、提油（莪術(shù)）、水煎（黃柏）去渣濃縮后配成藥液，濃度約為4.2 g/mL，高溫消毒后于4℃冰箱密封保存。由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所制備。

細胞總RNA提取試劑盒，購自北京愛普拜生物技術(shù)有限公司；DNase I， Amplification Grade，購自Invitrogen公司；GoScriptTM Reverse Transcription System，購自Promega公司；SsoAdvancedTM SYBR Green Supermix，購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3 細胞株 人宮頸癌SiHa細胞，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.4 儀器 普通PCR儀（C1000TM Thermal Cycler）、紫外凝膠成像（Bio-Rad Gel Doc XR+）、電泳儀（Powerpac）、微型離心機（Tornado），均購自美國Bio-Rad公司；4℃高速離心機（2-16PK），購自德國Sigma公司；微量分光光度計（NanoQTM），購自博奧生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1提取含藥血清 每日給藥一次（灌胃），每只（220±10）g大鼠灌藥量為（4.2±0.1）mL。連續(xù)灌服5 d，采血前12 h禁食，末次給藥1 h后采集全部血液（盡可能多的采血）；采全血后分離含藥血清，進行含藥血清的無菌處理。

1.2.2 q-PCR法檢測 IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ的基因表達情況：① 總RNA提取SiHa細胞傳代后，分別加入3 mL含有不同濃度（8%、4%、1%和0%）含藥血清和不含藥大鼠血清（1%）的MEM新鮮培養(yǎng)基（含有10%FBS和1g/L青霉素+鏈霉素），均設(shè)2個復(fù)孔，分別在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，分別提取RNA。具體為：（1）取1 mL RNA提取緩沖液試劑于6-well中，渦旋混勻，室溫放置10 min，其間渦旋3～4次；（2）加入200 μL三氯甲烷，渦旋混勻并室溫放置10 min，其間渦旋3～4次；（3）4℃，13000 rPm離心15 min；（4）吸500 μL上清，加入500 μL異丙醇，輕柔混勻；（5）上吸附柱。待混合液全部完畢，用700 μL RPW清洗柱子兩遍，每遍離心30 s；（6）將柱子空轉(zhuǎn)離心2 min；（7）充分晾干沉淀，用50 μL 65℃預(yù)熱的RNA Free Water溶解沉淀；（8）取1 μL進行電泳檢測。

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及q-PCR檢測 首先在PCR管中加入總體積為11.5 μL的預(yù)混試劑（分別為RNA 5 μg、Oligo（dT）15 Primer 0.5 μg、Nuclease-Free Water 6 μg）。然后，將混合物進行70°C下5 min預(yù)變性，完成后取出置于冰上。另外，配制預(yù)混試劑RT-Mix（分別為GoScriPtTM 5X Reaction Buffer4 μL、MgCl2 2 μL、PCR Nucleotide Mix1 μL、Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.4 μL、GoScriPtTM Reverse TranscriPtase 1 μL，共計8.4 μL），向上述預(yù)變性完成的每個樣品中加入10 μL RT-Mix。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序，包括退火、延伸、逆轉(zhuǎn)錄酶失活三步，反應(yīng)條件：25℃：5 min；42℃：60 min；70℃：15 min；4℃：60 min，程序完成后得到cDNA。最后，設(shè)計相應(yīng)引物，進行q-PCR檢測。設(shè)計引物序列見表1。

1.2.3 Western blot法檢測免疫因子的蛋白表達量 選取q-PCR法檢測中基因表達顯著增加的免疫因子，運用Western blot法檢測其蛋白表達量情況，其具體操作步驟如下：（1）蛋白提取及濃度測定：取出SiHa細胞2×105個放入打樣管用加入蛋白提取緩沖液進行打磨，將破碎好的樣品在冰上放置1 h，用低溫離心機離心（4℃，13 000 rPm，20 min）；吸取上清放入1.5 mL離心管中再次使用低溫離心機離心處理（4℃，13 000 rPm，20 min）后吸取上清備用。之后采用Bradford方法測定蛋白樣品的濃度；（2）轉(zhuǎn)膜：完成SDS-PAGE操作后，紫外激發(fā)后觀察蛋白電泳狀況，之后將此蛋白膠進行轉(zhuǎn)膜操作，轉(zhuǎn)膜用的夾子按照海綿-whatman濾紙-膠-PVDF膜-whatman濾紙-海綿-透明夾子部分夾好后用Bio-Rad濕式轉(zhuǎn)膜裝置進行轉(zhuǎn)膜操作；將整個裝置放置于大的冰盒中，加入TB-transfer buffer（恒流：400 mA）轉(zhuǎn)膜2 h；（3）封閉：轉(zhuǎn)膜完畢后，使用WB Enhancer Solution處理膜10 min，之后用PBS洗凈，再用5%的脫脂奶粉（用PBS配置）封閉液進行封閉，室溫下2 h或者4℃封閉過夜；（4）加入一抗：每個目標蛋白的一抗的稀釋度為1：1000；（5）洗膜：PBST（PBS+0.1%Tween 20）洗5次，每次5 min；（6）加入二抗：每個目標蛋白的二抗的稀釋度為1：1000；（7）洗膜：PBST洗5次，每次5 min后，加入超敏化學(xué)發(fā)光液處理3～5 min后直接儀器觀察并照相。endprint

1.3 觀察指標

免疫因子IL-2、IL-8、TNF-α、IFN-γ的基因表達和IL-8和TNF-α蛋白的表達。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

使用 SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 q-PCR法檢測細胞因子mRNA表達

不同濃度含藥血清于不同時間對SiHa細胞免疫相關(guān)因子mRNA表達結(jié)果見表2、表3、表4。在相同的時間內(nèi)，IL-8、TNF-α的mRNA表達在12 h、24 h都呈上升趨勢，48 h后下降。通過重復(fù)測量方差分析的檢驗，IL-8、TNF-α在1%濃度和8%濃度給藥后12～24 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P<0.05）。綜合表2、表3、表4，通過兩兩比較發(fā)現(xiàn)，對于特定的免疫因子，IL-2僅在24 h后檢測出表達量，在12 h、24 h均未能檢測出表達，且隨著含藥血清濃度增加，mRNA表達增加。IL-8、TNF-α的mRNA表達隨著含藥血清濃度增加而增加，在相同時間內(nèi)，24～48 h內(nèi)增加的濃度顯著大于12～24 h內(nèi)增加的濃度（P<0.05）。

2.2 Western blot法檢測結(jié)果

細胞內(nèi)IL-8、TNF-α蛋白表達量在含藥血清作用不同時間表達情況是定性實驗，每組挑選1個樣品進行試驗，其灰度數(shù)值見表5、表6，Western blot電泳見圖1。細胞內(nèi)IL-8蛋白表達量在8%濃度給藥后12～24 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升的趨勢，TNF-α蛋白表達量在8%濃度給藥后12～24 h呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。

3討論

宮頸癌是臨床上最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女健康。有研究表明[13-14]中醫(yī)藥所含有的抗腫瘤成分可以通過直接細胞毒作用或提高免疫力等途徑來達到抗腫瘤作用。中藥復(fù)方具有“天然組合化學(xué)庫”之稱，作用機制可能是通過多種藥物的藥理效應(yīng)共同起作用的結(jié)果，所以相對單一成分藥物，復(fù)方中藥有可能在療效上更具有優(yōu)勢[15]。清毒栓主要是由莪術(shù)、黃柏、紫草等組成的復(fù)方中藥。莪術(shù)抗腫瘤效應(yīng)的研究已經(jīng)達到分子水平，研究證實其主要成分姜黃素[16]具有抑制腫瘤細胞的作用，對處于各增殖周期的細胞均有不同程度的抑制作用。對于清毒栓抗腫瘤的分子機制，國內(nèi)目前已有相當?shù)难芯炕A(chǔ)。曹穎等[17]通過檢測主要組織相容性復(fù)合物-Ⅰ（MHC-Ⅰ）抗原呈遞通路相關(guān)分子TAP1、TAP2、LMP2、LMP7的蛋白及基因表達差異，認為中藥清毒栓可通過調(diào)節(jié)抗原呈遞通路相關(guān)分子的蛋白及基因表達，起到促進抗原呈遞的作用，這可能是該方療效的作用機制之一。金哲等[18]通過流式細胞技術(shù)，認為清毒栓及β-欖香烯可以上調(diào)HLA-Ⅰ蛋白及基因表達，從而加強宮頸癌細胞系HeLa表面的抗原呈遞，可能是這兩種藥物幫助機體清除人乳頭瘤病毒（HPV）感染及癌變細胞的機制之一。本研究從免疫因子的角度出發(fā)，通過檢測經(jīng)不同藥物濃度處理的SiHa宮頸癌細胞中常見免疫因子IL-8、TNF-α的基因表達情況，并檢測基因表達增高的因子蛋白表達量的變化，擬在免疫因子角度解釋清毒栓抗腫瘤作用。

本研究表明，不同劑量的清毒栓在12 h、24 h、48 h對宮頸癌SiHa細胞免疫相關(guān)細胞因子的基因表達均有一定促進作用，其中以IL-8、TNF-α在8%濃度給藥后12～24 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P<0.05）。腫瘤壞死因子（TNF-α）是由巨噬細胞和單核細胞分泌的一種多肽激素，是一種重要的細胞因子，是多種生理反應(yīng)和免疫過程的重要介質(zhì)[19]。IL-8是由單核-巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子，主要促進嗜中性粒細胞趨化、脫粒、釋放溶酶以加強炎癥防護；促進T 細胞趨化游走以加強機體免疫反應(yīng)[20]。這提示清毒栓可通過促進IL-8、TNF-α的基因表達來提高機體抗腫瘤能力，尤其是高劑量的清毒栓，對刺激基因的表達更為有效，但是具體通過哪一種途徑激活相關(guān)基因的表達，需要進一步深入至分子信號通路途徑方面的研究。通過進一步檢測IL-8、 TNF-α蛋白表達情況，分析表達量隨時間濃度的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)IL-8、 TNF-α蛋白表達量在高劑量組給藥后48 h呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P<0.05）。這證實高劑量的清毒栓可能通過刺激IL-8、 TNF-α基因的表達，進而促進IL-8、 TNF-α蛋白的表達。明確清毒栓主要起刺激作用的免疫因子，對進一步研究清毒栓抗腫瘤機制的免疫學(xué)研究有重要指導(dǎo)作用。

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（收稿日期：2017-08-22）endprint