化橘紅、連翹、當(dāng)歸混合揮發(fā)油提取及包合工藝研究

王文平 倪健 楊春靜 張欣 王慶玲 董曉旭 冷新 尹興斌 馮淬靈

化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，前者習(xí)稱“毛橘紅”，后者習(xí)稱“光七爪”“光五爪”[1]，味辛、苦，性溫，歸肺、脾經(jīng)，其功能是理氣寬中、燥濕化痰。藥理研究表明[2]化橘紅揮發(fā)油有明顯的鎮(zhèn)咳、化痰作用。連翹為木犀科植物連翹Forsythiasupensa(Thunb.)vahl的干燥果實(shí)，味苦，性微寒，具有清熱解毒，消腫散結(jié)，疏散風(fēng)熱的作用。文獻(xiàn)研究表明[3]，連翹揮發(fā)油具有抗炎作用，抗炎機(jī)理與抑制炎癥介質(zhì)PGE2和組胺、五羥色胺的釋放有關(guān)。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv)Diels的干燥塊根，具有補(bǔ)血活血，補(bǔ)氣調(diào)經(jīng)等功效[4]。當(dāng)歸揮發(fā)油中的藁本內(nèi)酯具有較強(qiáng)的解痙平喘作用[5]，可松弛支氣管平滑肌，對(duì)抗組織胺、乙酰膽堿引起的支氣管哮喘。

慢阻肺(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)與肺部的異常炎癥有關(guān)[6-7]，主要癥狀為氣短、慢性咳嗽、咳痰、喘息和胸悶。芪蛭益肺顆粒是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院治療COPD的臨床經(jīng)驗(yàn)方，方中化橘紅、當(dāng)歸、連翹三味藥的揮發(fā)油對(duì)COPD癥狀有明顯治療作用，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)以上三味藥采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，以揮發(fā)油的得率為指標(biāo)，優(yōu)化揮發(fā)油的提取工藝；為減少揮發(fā)油成分在制劑生產(chǎn)及儲(chǔ)藏過程損失，同時(shí)為了更好地將揮發(fā)油成分與水提浸膏混合，本實(shí)驗(yàn)對(duì)混合揮發(fā)油進(jìn)行包合，并以揮發(fā)油的得率為指標(biāo)，優(yōu)化揮發(fā)油的包合工藝[8]，并利用顯微成像分析和X射線衍射法對(duì)包合物進(jìn)行表征。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZNCL-S-10D多點(diǎn)智能磁力攪拌器(河南愛博特科技發(fā)展有限公司)，ZDHW型調(diào)溫電熱套(北京市中興偉業(yè)儀器有限公司，BT125D型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，DZ-28BC型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，XD-3X射線衍射儀(北京普析通用儀器有限公司)，Olympus顯微系統(tǒng)和DP71圖像采集系統(tǒng)。

1.2 試藥

藥材購(gòu)自北京同仁堂(亳州)飲片公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定：化橘紅(生產(chǎn)批號(hào)：501002809)為蕓香科植物柚Citrusgrandis‘Tomentosa’的干燥外層果皮，連翹(生產(chǎn)批號(hào)：500003182)為木犀科植物連翹Forsythiasupensa(Thunb.)vahl的干燥果實(shí)，當(dāng)歸(生產(chǎn)批號(hào)：501002827)為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv)Diels的干燥塊根。β-環(huán)糊精(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20151030)，無水乙醇(北京化工廠，批號(hào)：20160606)實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合揮發(fā)油的提取

稱取化橘紅、連翹、當(dāng)歸飲片，按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(四部)附錄2204揮發(fā)油測(cè)定法(甲法)提取，收集揮發(fā)油?；偌t、連翹、當(dāng)歸混合油為黃色透明液體，用封口膜密閉，置于4℃冷藏備用。

2.1.1 單因素考察 以揮發(fā)油的得率為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察浸泡與否、加水倍量、提取時(shí)間對(duì)化橘紅、當(dāng)歸、連翹混合揮發(fā)油得率的影響。將當(dāng)歸破碎成2 cm左右小塊，化橘紅、連翹不粉碎進(jìn)行揮發(fā)油提取。放大藥量至三味藥各加200 g，共600 g，進(jìn)行混合油最佳提取工藝的篩選。

2.1.2 浸泡與否的考察 稱取化橘紅、當(dāng)歸、連翹各200 g，共600 g，加入12倍量的水，分別浸泡0、2小時(shí)后提取。揮發(fā)油的提取量分別為2.88 mL、2.89 mL，由此得出結(jié)論：浸泡與否對(duì)于揮發(fā)油的得率沒有顯著影響，故選擇不浸泡提取揮發(fā)油，減少了工序，節(jié)省了時(shí)間和成本。

2.1.3 揮發(fā)油提取工藝的考察 稱取化橘紅、當(dāng)歸、連翹藥材各200 g，共600 g，分別加入10、12、14倍量的水，提取揮發(fā)油，記錄不同時(shí)間揮發(fā)油的提取量，為保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇同一電熱套、同一揮發(fā)油提取器，并且在提取過程中控制相同的溫度，本實(shí)驗(yàn)控制加熱條件，即調(diào)至360 V至沸騰，之后降至250 V保持微沸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明12倍量水提取所得揮發(fā)油量最大，揮發(fā)油得率為0.48%，并且提取10小時(shí)后揮發(fā)油提取量已達(dá)總量的90%，綜合中試加工時(shí)間限制及提取成本因素，選擇最佳提取工藝為12倍量水提取10小時(shí)。

2.1.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照優(yōu)選出來的揮發(fā)油的提取工藝，即化橘紅、連翹、當(dāng)歸每味藥加入200 g，不浸泡，加入12倍量水，提取10小時(shí)，平行進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定可行。

表1 揮發(fā)油提取工藝結(jié)果

表2 揮發(fā)油提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.2 包合工藝的考察

2.2.1 空白回收率 實(shí)驗(yàn)取1 mL揮發(fā)油于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水，測(cè)得揮發(fā)油的空白回收率為80%。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)通過查閱文獻(xiàn)[9-10]及綜合考慮揮發(fā)油包合物制備方法，選擇飽和水溶液法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合。正交實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表，以揮發(fā)油的包合率為指標(biāo)，考察影響包合物生成的三因素包合溫度、包合時(shí)間、油(mL)∶β-CD(g)∶水(mL)比例對(duì)包合物生成的影響，每個(gè)因素下三個(gè)水平。因素水平見表3。

表3 包合工藝正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.3 包合物的制備 按照正交表4，稱取規(guī)定重量的β-CD于錐形瓶中，分別加入蒸餾水60 mL、80 mL、100 mL于設(shè)定好溫度的水浴鍋上加熱溶解，制成β-CD飽和溶液，置于磁力攪拌器上恒溫。揮發(fā)油1 mL加無水乙醇制成50%(v/v)的無水乙醇溶液，超聲使油與無水乙醇混合均勻，之后緩慢加入到環(huán)糊精溶液中，加塞，攪拌至規(guī)定時(shí)間，冷卻至室溫，放入冰箱，冷藏24小時(shí)，抽濾，包合物用適量的水洗滌，再用10 mL無水乙醇洗滌，濾層和濾紙一同取出，置于真空干燥箱中，40℃下干燥4小時(shí)，即得。

2.2.4 包合率的測(cè)定 分別取9組干燥好的包合物，置于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水，連接揮發(fā)油提取裝置，提取揮發(fā)油，保持微沸5小時(shí)，至油量不再增加，計(jì)算揮發(fā)油的包合率，結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。結(jié)果分析：由方差分析結(jié)果顯示，A、B、C三因素的P值均小于0.05，說明A、B、C三因素均具有顯著性差異，通過k值比較，最終確定最佳提取工藝為A2B3C3，即40℃，油(mL)∶β-CD(g)∶比例為1∶10∶100，提取3小時(shí)。

表4 混合揮發(fā)油β-CD包合工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 混合揮發(fā)油β-CD包合工藝的方差分析

2.2.5 三批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照優(yōu)選的揮發(fā)油的最佳包合工藝，進(jìn)行3批平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表6，三批驗(yàn)證試驗(yàn)平均包合率為95.83%，大于正交表中的最佳包合率93.75%，說明該包合工藝穩(wěn)定可行。

表6 揮發(fā)油包合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.3 包合物表征

2.3.1 包合物的顯微成像 分別取適量β-CD、揮發(fā)油與β-CD物理混合物及包合物，過100目篩，分別放于3張載玻片上，以少量蒸餾水分散溶解，蓋上蓋玻片，于10×10倍顯微鏡下觀察。β-CD、揮發(fā)油與β-CD物理混合物、揮發(fā)油包合物顯微圖分別如圖1所示。β-CD在顯微鏡下呈不規(guī)則透明團(tuán)塊，成像清晰；物理混合物類似于β-CD，且有大量細(xì)小油滴存在。包合物的顯微圖與以上二者具有明顯區(qū)別，包合物已經(jīng)形成且包合狀態(tài)良好。

注：A為β-CD；B為物理混合物；C為包合物

2.3.2 X射線衍射法 取空白β-CD、混合揮發(fā)油與β-CD的物理混合物、β-CD與混合油的包合物分別進(jìn)行X射線衍射，以掃描角度為橫坐標(biāo)，衍射強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，采用Origin軟件繪制X射線粉末衍射圖。結(jié)果如圖2所示。由圖所示，包合物的衍射峰在2θ=6～8°、 16～18°、 20°、 24°產(chǎn)生新的吸收峰，在2θ=10°、 26～27°、 32°、 35°的峰消失，說明混合油與β-CD形成了包合物。

注：A為β-CD；B為物理混合物；C為包合物

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)代包合技術(shù)，將揮發(fā)油包合在β-CD分子之中，獲得穩(wěn)定的包合物。本研究結(jié)果顯示，最佳提取工藝是不浸泡，加10倍量水，提12小時(shí)。最佳包合工藝為：油(mL)∶β-CD(g)∶水(mL)比例為1∶10∶100，包合溫度為40℃，包合時(shí)間為3小時(shí)。通過顯微鏡法、X射線衍射法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行表征，結(jié)果顯示包合物形成且包合狀態(tài)良好。該工藝操作方便，實(shí)用性強(qiáng)，有利于生產(chǎn)。

化橘紅、當(dāng)歸、連翹的混合揮發(fā)油成分比較復(fù)雜，單憑揮發(fā)油的提取率和包合率來表示揮發(fā)油的提取會(huì)有一定的局限性。后期可以測(cè)定一下不同提取工藝和包合工藝中各成分含量差別進(jìn)行完善。

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