扶正祛毒方對(duì)慢性乙肝病毒攜帶者血IFN-γ表達(dá)影響的研究

郭子寧 張立平 黃象安 彭龍 金艷

慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)攜帶者具有“HBV高水平復(fù)制”和“轉(zhuǎn)氨酶正?；虻退健眱纱筇攸c(diǎn)，結(jié)局高危，需要早期干預(yù)已經(jīng)成為共識(shí)[1]。目前研究認(rèn)識(shí)到其核心機(jī)制為免疫耐受[2]，遺憾的是，當(dāng)前除了早期隨訪，定期觀察外無有效治療手段。中醫(yī)藥具有多靶標(biāo)、雙向調(diào)節(jié)作用，近年來在諸多疑難問題上取得可觀成績，具備深入研究價(jià)值。扶正祛毒方以扶正祛毒立法，課題組早期在臨床及實(shí)驗(yàn)中觀察到其抑制HBV復(fù)制和保護(hù)肝細(xì)胞的作用，本研究擬觀察其對(duì)慢性HBV攜帶者的治療作用，探討其對(duì)在免疫清除機(jī)制中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子干擾素(interferon-γ,IFN-γ)表達(dá)的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選取2015年10月～2017年4月期間來北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院肝炎門診就診，年齡18～65歲，符合慢性HBV攜帶者診斷的患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《2010版中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”》，排除同時(shí)感染其他類型肝炎、HIV者；合并有其他臟器的衰竭，如心、腎功能衰竭，以及精神疾病、惡性腫瘤等疾病者；患有自身免疫系統(tǒng)疾病如原發(fā)性膽汁性肝硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎者；入組前6個(gè)月內(nèi)有干擾素或核苷類抗病毒藥物以及免疫增強(qiáng)或抑制劑的用藥史者；妊娠或哺乳期以及3個(gè)月內(nèi)參加過其他臨床試驗(yàn)者。知情同意后入組，共入組30例，失訪4例。

1.2 試驗(yàn)藥物

扶正祛毒方由黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、蒲公英15 g、半枝蓮15 g、郁金10 g、白花蛇舌草15 g、醋柴胡10 g、炙甘草6 g組成，制備成200 mL湯劑，2密封袋分裝，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥學(xué)部完成鑒定和制備，4℃冷藏。服用方法為早、晚各1袋，餐后半時(shí)口服，連續(xù)服藥12周。

1.3 主要儀器與試劑

全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，Thermo，產(chǎn)地美國)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特)，MINI shaker(MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER)，HBeAg及 IFN-γELISA試劑盒(批號(hào)20170715，均購自聯(lián)科生物試劑公司)。

1.4 檢測指標(biāo)

取血清后，全自動(dòng)生化分析儀檢測血清ALT、AST水平；RT-PCR法檢測HBV DNA滴度：采用羅氏(LightCycler 480)實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增儀，加處理液a，離心，棄上清后提取蛋白，加處理液b震蕩混勻，高溫解鏈，離心提取核酸，取細(xì)管加酶18 μL，提取液2 μL，離心后，上機(jī)擴(kuò)增，讀取熒光標(biāo)記物含量；ELISA測HBeAg及細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)：按試劑盒說明書包被，加樣，加酶標(biāo)抗體，底物液顯色，根據(jù)顏反應(yīng)來判定HBsAg、HBeAg以及IFN-γ的含量。

1.5 觀察時(shí)點(diǎn)

分別于患者入組第1天、用藥后第12周末空腹采血。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 扶正祛毒方對(duì)慢性HBV攜帶者療效判定指標(biāo)的影響

由于差值不符合正態(tài)分布，選用非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon)，結(jié)果顯示，扶正祛毒方治療12周后，患者HBV DNA復(fù)制水平較治療前下降，差異顯著(P<0.05)，見表1。與此同時(shí)，患者血清HBeAg亦較前下降，差異顯著(P<0.05)，見表2。

2.2 扶正祛毒方對(duì)慢性HBV攜帶者血清細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，扶正祛毒方治療12周后，慢性HBV攜帶者血清細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)較治療前上升，差異顯著(P<0.05)，見表3。

表1 扶正祛毒方治療前后血清HBV DNA復(fù)制的變化

表2 扶正祛毒方治療前后血清HBeAg的變化

表3 扶正祛毒方治療前后血清IFN-γ表達(dá)的變化

3 討論

慢性HBV攜帶者指HBV慢性感染后肝臟無明顯炎癥活動(dòng)的攜帶狀態(tài)，多為處于免疫耐受期的HBsAg、HBeAg、HBV DNA陽性者，血清ALT、AST在正常范圍，肝組織學(xué)檢查無明顯異常，常隱匿進(jìn)展為肝硬化或肝癌，被稱為“高危結(jié)局HBV攜帶者”[3]。雖然早期干預(yù)慢性HBV攜帶者已經(jīng)成為業(yè)內(nèi)共識(shí)[4]，但由于本期免疫無應(yīng)答，此期治療一般無療效，因此目前指南只建議做定期隨訪。近年來中醫(yī)藥在臨床尤其是個(gè)案中取得良好成效，主要體現(xiàn)在對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用，維持轉(zhuǎn)氨酶正常水平，對(duì)肝纖維化逆轉(zhuǎn)作用等[5]。

課題組認(rèn)識(shí)到慢性HBV攜帶者“正虛毒伏”的病機(jī)關(guān)鍵，從正虛毒伏與免疫耐受病理基礎(chǔ)的相通性出發(fā)，扶正祛毒，以期打破免疫耐受，抑制病毒復(fù)制的同時(shí)避免肝臟炎性損傷。本研究結(jié)果顯示，扶正祛毒方治療12周后，HBV DNA的復(fù)制、HBeAg的表達(dá)均明顯下降。HBV DNA是反應(yīng)HBV復(fù)制與否最直接的指標(biāo)，也是臨床診斷、療效判定的關(guān)鍵；HBeAg表達(dá)的強(qiáng)弱則提示病毒復(fù)制的程度和傳染性強(qiáng)弱，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，提示扶正祛毒方抑制HBV復(fù)制的作用是肯定的，與此同時(shí)，患者血清轉(zhuǎn)氨酶水平在正常范圍，轉(zhuǎn)氨酶是反映肝臟功能的重要指標(biāo)，也是肝臟炎癥活動(dòng)最靈敏的指標(biāo)之一，結(jié)果顯示，扶正祛毒方對(duì)慢性HBV攜帶者肝功能無不良作用。

IFN-γ是活化細(xì)胞免疫，清除病毒的效應(yīng)細(xì)胞因子。研究表明，IFN-γ可以通過多個(gè)環(huán)節(jié)抑制HBV DNA的復(fù)制。包括阻止HBV核衣殼的形成,促進(jìn)其在肝細(xì)胞漿中降解、清除HBV核衣殼顆粒及其包裝的HBV復(fù)制中間體，影響RNA的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯。IFN-γ還可以通過與靶細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)靶細(xì)胞合成抗病毒蛋白(antiviralprotein,AVP)如蛋白激酶(protein kinase resource,PKR)，抑制HBV復(fù)制而不損傷肝靶細(xì)胞，介導(dǎo)非肝細(xì)胞損傷的抗病毒作用，IFN-γ清除HBV的過程被認(rèn)為可以完全獨(dú)立于肝臟損傷的過程[6-7]。因此，IFN-γ表達(dá)的升高，有助于清除病毒，抑制其復(fù)制。本研究結(jié)果顯示，扶正祛毒方治療12周后，血清IFN-γ表達(dá)上升，相應(yīng)的，HBV DNA的復(fù)制明顯下降，這意味著扶正祛毒方可能是通過上調(diào)IFN-γ，活化免疫，從而抑制病毒復(fù)制的。

值得思考的是，雖然本研究顯示扶正祛毒方可以抑制慢性HBV攜帶者病毒復(fù)制，但治療前較治療后下降約1log值，這與指南所界定的抗病毒藥物的有效標(biāo)準(zhǔn)仍有距離，可能是由于如下原因：(1)治療時(shí)間較短，未達(dá)到指南判定療效的時(shí)間節(jié)點(diǎn)24周；(2)扶正祛毒方以扶正祛毒為立法，旨在調(diào)節(jié)免疫耐受狀態(tài)，這與核苷(酸)類抗病毒藥物的作用機(jī)理是不同的。從長遠(yuǎn)來看，扶正祛毒方從慢性HBV攜帶者免疫耐受的核心機(jī)制出發(fā)，安全、有效，其遠(yuǎn)期療效值得期待，其作用機(jī)制更具深入探討的價(jià)值。

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