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    黃芪甲苷、人參皂苷Rg1對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠Hedgehog信號(hào)通路的調(diào)控影響

    2018-01-12 07:17:41趙唯含史瑞楊美娟高康麗李寧飛李軍祥
    環(huán)球中醫(yī)藥 2017年12期
    關(guān)鍵詞:甲苷皂苷人參

    趙唯含 史瑞 楊美娟 高康麗 李寧飛 李軍祥

    慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病,以胃黏膜上皮和腺體萎縮或伴有腸化生及不典型增生為特征表現(xiàn)[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于本病的治療主要是緩解癥狀,如應(yīng)用促胃動(dòng)力藥、胃黏膜保護(hù)劑及抑酸劑等,而中醫(yī)藥憑借其優(yōu)勢(shì)在治療CAG中扮演著重要角色[2]。黃芪和三七是健脾益氣和活血化瘀藥的代表,黃芪中的主要有效成分是黃芪甲苷,三七中的主要有效成分是人參皂苷Rg1。以往研究發(fā)現(xiàn)黃芪及三七可以通過激活Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵因子改善萎縮性胃炎大鼠胃黏膜的萎縮狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)黃芪和三七的有效成分黃芪甲苷及人參皂苷Rg1治療CAG的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康雄性Wistar大鼠80只,體重(160±20) g,SPF級(jí),由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK(京)20090007,飼養(yǎng)于北京市中醫(yī)研究所SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)間,12小時(shí)光照/黑夜循環(huán),相對(duì)恒溫(25℃),恒濕(75%)。

    1.2 試劑與藥物

    黃芪甲苷(Astragaloside IV,AST)分子式:C41H68O14,分子量784,標(biāo)準(zhǔn)品,購自北京市藥品檢驗(yàn)所,編號(hào):110781;人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1,GSS):標(biāo)準(zhǔn)品,購自北京萬誠科貿(mào)有限公司,純度≥98%(HPLC); Purmorphamine購自上海浩然生物有限公司; 特異性抗體Shh購自美國(guó)CST公司,Gli-1、Ptch、SUFU、CyclinD1和β-actin購自美國(guó)abcam公司;辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標(biāo)記羊抗鼠或兔抗羊二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;組織裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自美國(guó)Promega公司;ReverTra Ace qPCR RT Kit和THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix購自日本Toyobo公司;PV-9001、PV-9003免疫組化檢測(cè)試劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

    采用幽門彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法制備萎縮性胃炎大鼠模型[3]。造模結(jié)束后,運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將造模動(dòng)物分為模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷高劑量組、Purmorphamine組及葉酸組,每組10只,另設(shè)10只空白組??瞻捉M和模型組予去離子水灌胃2 mL/天;黃芪甲苷低劑量予水溶液1.5 mg/(kg·d)灌胃;高劑量予3 mg/(kg·d),人參皂苷Rg1低劑量予0.5 mg/(kg·d)灌胃, 高劑量予1 mg/(kg·d);Purmorphamine組予Purmorphamine水溶液1.6 mg/(kg·d)灌胃,共治療8周。

    1.4 標(biāo)本的采集

    實(shí)驗(yàn)大鼠禁食水16小時(shí),10%水合氯醛4 mL/100 g體重腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈取血后,沿胃大彎剪開,除去胃內(nèi)容物,生理鹽水沖洗干凈,展開照相,大體觀察;取幽門與前胃與腺胃交界線連線的2/5部分,放入凍存管內(nèi),液氮條件下保存,用于Western blot及PCR實(shí)驗(yàn);胃竇部橫向條狀取材,用10%中性福爾馬林液固定,石蠟包埋,切片用于HE染色及免疫熒光。

    1.5 Western Blot檢測(cè)胃組織Shh、Ptch、Gli-1的蛋白表達(dá)

    組織塊稱重,加入液氮,研磨并粉碎組織,加細(xì)胞裂解液50 μL,在冰上進(jìn)行勻漿離心處理,取蛋白上清液,測(cè)定總蛋白濃度。調(diào)整濃度以后進(jìn)行電泳分離,把蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,用5%的脫脂牛奶封閉2小時(shí)。將封閉膜放入一抗中,4℃過夜,洗凈未結(jié)合的一抗,然后放入二抗工作液中,室溫孵育2小時(shí)?;叶戎捣治霾捎肐mageJ軟件。

    1.6 RT-PCR檢測(cè)胃組織Shh mRNA、Ptch mRNA、Gli-1 mRNA表達(dá)

    把組織放入研缽中,研磨成粉末狀,Trizol試劑法提取樣本的總RNA,經(jīng)ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再將此設(shè)為模板,利用特異性引物合成PCR產(chǎn)物。大鼠的引物序列及產(chǎn)物大小見表1。以β-actin基因作為內(nèi)參,將標(biāo)本的待測(cè)指標(biāo)和內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,相對(duì)定量數(shù)據(jù)處理使用2-△△Ct法。

    表1 引物序列及產(chǎn)物大小

    1.7 量子點(diǎn)介導(dǎo)的免疫熒光法檢測(cè)胃黏膜組織SUFU、CyclinD1蛋白的表達(dá)

    石蠟切片脫蠟、水化、微波抗原修復(fù)、TBS洗滌,封閉緩沖液37℃濕盒孵育60分鐘,分別滴加SUFU、CyclinD1抗體,37℃孵育2小時(shí),TBS-T漂洗5 分鐘/次×3次,封閉緩沖液37℃濕盒孵育20分鐘,滴加QDs-SA標(biāo)記的二抗,37℃濕盒孵育30分鐘,TBS-T漂洗5分鐘/次×3次,滴加緩沖甘油封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察,每個(gè)組織隨機(jī)采集5張圖片拍照。用image pro plus 6.0 軟件分析圖像。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠胃黏膜組織肉眼及病理觀察

    2.1.1 肉眼觀察 空白組大鼠黏膜紅潤(rùn);模型組大鼠前胃無明顯變化,腺胃黏膜表面黃染,暴露黏膜顏色發(fā)白。

    2.1.2 病理學(xué)評(píng)價(jià) 空白組大鼠黏膜結(jié)構(gòu)正常,腺體整齊緊密;模型組胃黏膜變薄,出現(xiàn)萎縮,固有層腺體減少,排列稀疏,有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),個(gè)別可見淋巴濾泡形成;各給藥組較模型組比較黏膜萎縮情況有不同程度的改善,腺體排列較整齊,其中以黃芪甲苷高劑量組和人參皂苷Rg1高劑量組為最佳。見圖1。

    2.2 各組大鼠胃組織Shh、Ptch、Gli-1蛋白表達(dá)的比較

    與空白組比較,模型組大鼠胃組織Shh、Ptch、Gli-1蛋白含量均顯著降低(P<0.05);與模型組比較,人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組及葉酸組Shh蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),各給藥組均能顯著升高Ptch蛋白含量(P<0.05)。人參皂苷Rg1高劑量組、Purmorphamine組Gli-1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),見表2、圖2。

    注:A:空白組;B:模型組;C:黃芪甲苷低劑量組;D:黃芪甲苷高劑量組;E:人參皂苷Rg1低劑量組;F:人參皂苷Rg1高劑量組;G:Purmorphamine組;H:葉酸組

    表2 各組大鼠胃組織Shh、Ptch、Gli-1蛋白表達(dá)

    注: 與空白組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01。

    表3 各組大鼠胃組織Shh、Ptch、Gli-1 mRNA表達(dá)

    注: 與空白組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01。

    圖2 胃組織Shh、Ptch及Gli-1的Western Blot表達(dá)

    2.3 各組大鼠胃組織Shh、Ptch、Gli-1基因表達(dá)的比較

    與前述Western Blot檢測(cè)結(jié)果基本一致, 與空白組比較, 模型組大鼠胃組織Shh、 Ptch、 Gli-1的mRNA含量均顯著降低(P<0.05); 與模型組比較, 人參皂苷Rg1高劑量組對(duì)Shh、 Ptch有改善作用(P<0.05), 黃芪甲苷低劑量和高劑量組均可顯著改善Gli-1的基因表達(dá)(P<0.05), Purmorphamine組對(duì)于Shh、 Ptch、 Gli-1均療效顯著(P<0.05)。 見表3。

    2.4 各組大鼠SUFU蛋白表達(dá)情況

    與空白組相比較,模型組SUFU蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01);與模型組比較,黃芪甲苷高劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組和Purmorphamine組SUFU蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.05)。見圖3、表4。

    2.5 各組大鼠CyclinD1蛋白表達(dá)情況

    與空白組相比較,模型組CyclinD1蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.01);與模型組比較,黃芪甲苷高劑量組和Purmorphamine組均表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。見圖4、表5。

    注:A:空白組;B:模型組;C:黃芪甲苷低劑量組;D:黃芪甲苷高劑量組;E:人參皂苷Rg1低劑量組;F:人參皂苷Rg1高劑量組;G:Purmorphamine組;H:葉酸組

    注:A:空白組;B:模型組;C:黃芪甲苷低劑量組;D:黃芪甲苷高劑量組;E:人參皂苷Rg1低劑量組;F:人參皂苷Rg1高劑量組;G:Purmorphamine組;H:葉酸組

    表4 量子點(diǎn)標(biāo)記各組大鼠SUFU的表達(dá)情況

    注: 與空白組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05,cP<0.01。

    表5 量子點(diǎn)標(biāo)記各組大鼠CyclinD1的表達(dá)情況

    注:與空白組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05,cP<0.01。

    3 討論

    Hedgehog信號(hào)通路幾乎涉及哺乳動(dòng)物發(fā)育的所有過程,目前關(guān)于其與腫瘤的調(diào)控研究較為透徹[4]。Hedgehog信號(hào)通路主要由三部分組成:Hh信號(hào)肽(Shh、Ihh、Dhh)、跨膜受體(Ptch、Smo)和下游轉(zhuǎn)錄因子(Gli)。Shh參與多種誘導(dǎo)過程,在胚胎胚芽不對(duì)稱性發(fā)育和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程發(fā)揮成形素、分裂素以及分化因子等作用[5]。Shh蛋白釋放后與Ptch結(jié)合,解除了Ptch對(duì)Smo的抑制作用,進(jìn)而將信號(hào)向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)傳遞,激活下游的Gli轉(zhuǎn)錄因子[6]。Gli-1是一種轉(zhuǎn)錄激活劑,Hh信號(hào)通路的激活可以上調(diào)Gli-1的表達(dá),有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)Shh表達(dá)不足時(shí),Gli-1也會(huì)降低,而Shh被激活時(shí),Gli-1將會(huì)表達(dá)上調(diào),因此Gli-1也常被作為檢測(cè)Hedgehog信號(hào)通路是否激活的代表性分子[7]。Sufu是Hedgehog通路中處在Smo和Gli之間的Fused抑制物,Gli基因的活化需要Sufu處于抑制狀態(tài),而Smo的活化可以抑制Sufu的功能。CyclinD1是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子,在G1期含量最高且活性最大,通路異?;罨罂梢陨险{(diào)CyclinD1蛋白表達(dá)[8]。Purmorphamine是一種小分子嘌呤衍生物,可以作為Hedgehog信號(hào)通路的特異性激活劑[9]。

    黃芪甲苷(又稱黃芪皂苷Ⅳ,Astragaloside Ⅳ)為中藥黃芪主要有效成分之一,現(xiàn)代藥理研究其有鎮(zhèn)靜、降壓、消炎、影響蛋白合成、促進(jìn)NK細(xì)胞活性等作用,是黃芪的重要生理活性成分[10]。三七中皂苷成分是三七的主要有效成分之一,目前已從三七的不同部位分離得到60余種單體皂苷成分,其中人參皂苷Rg1是三七總皂苷中最具代表性的特征化合物,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,人參皂苷Rg1在體內(nèi)可被代謝為Rh1,起到促進(jìn)免疫應(yīng)答的作用,表現(xiàn)為一定的抗腫瘤活性[11]。

    本實(shí)驗(yàn)采用幽門彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法構(gòu)建CAG大鼠模型,該模型以胃竇萎縮為主,炎癥浸潤(rùn)明顯,符合一般萎縮性胃炎特征。在前期實(shí)驗(yàn)中,黃芪、三七作為益氣活血法的代表藥物,可以顯著升高Hedgehog信號(hào)通路中正反饋因子,降低負(fù)反饋因子表達(dá),進(jìn)一步維護(hù)細(xì)胞凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡,保護(hù)胃黏膜[12]。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要單體成分,人參皂苷Rg1是中藥三七的主要單體成分,且含量最高,因此本次實(shí)驗(yàn)選擇了黃芪甲苷和人參皂苷Rg1探索中藥黃芪、三七的有效成分對(duì)大鼠CAG的作用機(jī)制。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的高低劑量組對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠的病理情況均有不同程度的改善,抑制萎縮及炎癥發(fā)生。對(duì)CAG大鼠Hedgehog通路相關(guān)因子進(jìn)行檢測(cè),人參皂苷Rg1低劑量組和高劑量組可升高Shh、Ptch的表達(dá),其中以高劑量組改變明顯;黃芪甲苷高劑量組顯著改善Gli-1的表達(dá),及升高CyclinD1的蛋白表達(dá)。

    綜上,在慢性萎縮性胃炎發(fā)生發(fā)展過程中,中藥黃芪及三七的主要單體成分黃芪甲苷、人參皂苷Rg1對(duì)Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵因子均有一定的激活作用,由結(jié)果發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1主要作用于Hedgehog通路的上游因子,而黃芪甲苷主要作用的靶點(diǎn)因子處于Hedgehog通路的下游,其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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