應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩查針刺人迎穴對原發(fā)性高血壓大鼠下丘腦基因表達(dá)譜的影響

郭妍 石學(xué)敏 趙瑞利 蘆娟 馬田

原發(fā)性高血壓簡稱高血壓，以舒張壓和(或)收縮壓升高為主要臨床表現(xiàn)，病因復(fù)雜，多伴有心臟、血管、腦和腎臟等器官功能性或器質(zhì)性改變的全身性疾病。血壓升高主要是由于動脈阻力血管功能或結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致外周血管阻力增加，左心室的后負(fù)荷加重，心室壁增厚甚至惡化，導(dǎo)致左心室結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，主要會引起心室肥大、冠脈重建、心絞痛、心肌梗死和心力衰竭等一系列嚴(yán)重心血管疾病[1]，因此治療高血壓及其對靶器官心臟的損害刻不容緩。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，工作壓力增大及人們生活方式的改變，高血壓的患病率呈持續(xù)增長趨勢，有效平穩(wěn)地控制血壓已經(jīng)成為全球重要的公共衛(wèi)生問題之一[2]。在疾病發(fā)生的過程中，大多伴有多種基因的改變[3]，但各種針對血壓干預(yù)的方法是否逆轉(zhuǎn)了基因的改變或影響基因向病態(tài)發(fā)展，這方面的研究少之又少。針刺目前已成為一種治療高血壓病較理想的重要手段，并且深受廣大患者的歡迎。而對近年來針灸的臨床進(jìn)展的觀察得知，針刺可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)從而影響交感神經(jīng)興奮性[4]，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮異常功能[5]，調(diào)節(jié)外周血管的壓力[6]，調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，增加血漿中鈉鉀排泄[7]，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[8]等途徑來達(dá)到降壓效果。

基因芯片技術(shù)是一種分析基因表達(dá)的新方法，具有高靈敏度、高通量等特性。它能在檢測基因表達(dá)多樣性的同時，為研究高血壓多基因表達(dá)的影響提供了一個平臺[9]。這是一種從基因水平探知高血壓發(fā)病原理的高科技方法。本課題組以SHR作為研究對象，針刺人迎穴為主要干預(yù)手段，運用基因芯片技術(shù)，篩選出與血壓相關(guān)的差異表達(dá)的基因，從基因?qū)用嫣骄扛哐獕旱陌l(fā)病原理，針刺降壓及對下丘腦的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級9周齡自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHR)雄性20只，體重180～200 g，按照隨機數(shù)字表分為人迎組和模型組，每組10只。另取同體重SPF級9周齡Wistar Kyoto(WKY)大鼠10只作為空白對照組。動物均由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(京)200223。

1.2 主要儀器和試劑

一次性毫針(0.16×7 mm)購自北京中研太和醫(yī)療器械有限公司；型號為BP-6的無創(chuàng)血壓儀購自成都泰盟生物儀器有限公司；凍存管購自北京健力園科技有限公司；超凈操作臺生產(chǎn)于北京亞泰科隆儀器有限公司；手術(shù)器械、移液槍及型號為ACS-5的電子秤均由北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院提供。生理鹽水、水合氯醛、無水乙醇購自天津市科密歐化學(xué)試劑中心；多聚甲醛購自常德市華生醫(yī)療器械有限公司；液氮購自中國計量科學(xué)研究院。

1.3 取穴

根據(jù)《實驗針灸學(xué)》教材選取雙側(cè)人迎穴：頸部三角區(qū)，當(dāng)胸骨舌骨肌與胸鎖乳突肌上緣交點，約頸總動脈分叉處，即兩側(cè)下頜骨隅突連線下8 mm，前正中線旁開3.50 mm，左右各一。

1.4 干預(yù)方法

人迎組：將大鼠置于自制鼠套中束縛，以右手為刺手，針刺雙側(cè)人迎穴，直刺約4～5 mm，進(jìn)針后行捻轉(zhuǎn)瀉法1分鐘，留針19分鐘。(每天中午12點進(jìn)行一次，共操作28天，所有針刺操作均由1人完成)。

模型組及空白組：分別將大鼠放入自制鼠套中20分鐘，不作任何針刺干預(yù)。

1.5 血壓測量

測壓前，檢測無創(chuàng)血壓儀是否運轉(zhuǎn)正常，儀器是否靈敏。

將固定于鼠籠的大鼠放入36℃左右的預(yù)熱箱約15分鐘，開始測量其尾動脈收縮壓，動作要輕柔，不能激惹大鼠，測壓過程中保持安靜，以免血壓不穩(wěn)定。在正式測量血壓之前，可進(jìn)行訓(xùn)練若干次，待大鼠熟練適應(yīng)后開始實驗。

實驗前一天，各組大鼠用無創(chuàng)血壓儀測量尾動脈收縮壓，共測量3次，取平均值并記錄。在針刺干預(yù)治療進(jìn)行中的第1、5、9、13、17、21、25和28天分別測量其尾部收縮壓，每只大鼠3次，取平均值作記錄。

1.6 實驗取材

三組大鼠在麻醉狀態(tài)下取材并處死，每組大鼠取2只全腦置于固定液中以備做形態(tài)學(xué)檢測，其余大鼠則迅速取出下丘腦，用4℃ 0.9%生理鹽水沖洗后用濾紙吸干于液氮中固定，保存于-80℃冰箱中待檢。

1.7 基因芯片檢測

分別將人迎組、模型組和空白組的24只大鼠全部下丘腦組織樣本取出100 mg，研磨成均勻粉末狀，應(yīng)用mirVana miRNA isolation技術(shù)從中提取總RNA，并對其質(zhì)量和純度進(jìn)行鑒定。嚴(yán)格依照Affymetrix protocol試劑盒說明對樣本進(jìn)行操作，于北京博朗生科技有限公司進(jìn)行基因芯片的制備、RNA標(biāo)記、芯片雜交和掃描分析[首先進(jìn)行cRNA的制備→合成cDNA→用RNase H進(jìn)行水解→對cDNA進(jìn)行標(biāo)記制成基因芯片→分別用Affymetrix Gene Chip 645系統(tǒng)對芯片進(jìn)行雜交→使用Affymetrix Gene Chip 450系統(tǒng)進(jìn)行洗染(將未雜交分子洗去)，雜交成功的分子進(jìn)行染色→用Affymetrix Gene Chip 7G microarray scanner進(jìn)行掃描]。

1.8 基因芯片數(shù)據(jù)分析

將掃描的CEL格式圖像輸入到Affymetrix Expression console software，對基因芯片圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用Robust Multichip Average計算方法對基因數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理之后，用熒光共聚焦顯微鏡掃讀結(jié)果進(jìn)行比較分析，得到各組基因的熒光信號強度，由于正確堿基互補雙鏈具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性，因此，探針與樣品分子在某位點配對有差異時，該位點的熒光強度就會有所不同。將空白組與模型組、模型組與人迎組的基因的熒光信號強度進(jìn)行比較，并用Transcriptome Analysis console對比值進(jìn)行分析，判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)及篩選出樣本之間的差異表達(dá)基因：兩個基因比值的fold change≥1.5為表達(dá)上調(diào)，fold change≤-1.50為表達(dá)下調(diào)，-1.50～1.50之間為不存在顯著表達(dá)差異。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓的變化

28天干預(yù)治療結(jié)束后，可以看到模型組的收縮壓明顯升高。與空白組比較，人迎組在第1、5、9、13、17、21、25和28天所測收縮壓中明顯持續(xù)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組對比，人迎組在干預(yù)過程中第1、5、9天收縮壓有所降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在第13、17、21、25和28天顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

2.2 基因芯片篩查結(jié)果

與空白組相比：模型組共有372個差異表達(dá)基因，其中243個基因表達(dá)下調(diào)，129個基因表達(dá)上調(diào)(P<0.01且fold change≥1.50)。與模型組比較：人迎組共有355個差異表達(dá)基因，其中188個基因表達(dá)下調(diào)，167個基因表達(dá)上調(diào)(P<0.01且fold change≥1.50)。在模型組上調(diào)同時在人迎組下調(diào)的基因有75個(見圖1-A)，其中有意義的基因有EPHX2、CHI3L1、Acsm3、Tstd1、MGC108823、Naip5、RGD1310641、Wdr46、Pus71等。詳見表2。在模型組中下調(diào)并在人迎組中上調(diào)的基因有67個(見圖1-B)，其中有意義的基因有5-HT1A、KLK1、CBS、Ifitl、Cd4、Pnpla1、Zcchc9、Ppp2r4、Tnnt1等。詳見表3。

表1 治療后各組大鼠收縮壓的變化

注： 與空白組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01，cP<0.05。

注：圖A：模型組/空白組中上調(diào)的基因與人迎組/模型組中下調(diào)的基因；圖B：模型組/空白組中下調(diào)的基因與人迎組/模型組中上調(diào)的基因

表2 在模型組中表達(dá)上調(diào)，同時在人迎組下調(diào)的基因

注： Gene abbr：基因縮寫；FC1：基因在模型組的表達(dá)水平/基因在空白組的表達(dá)水平；FC2：基因在人迎組的表達(dá)水平/基因在模型組的表達(dá)水平。

表3 在模型組中表達(dá)下調(diào)，同時在人迎組上調(diào)的基因

注： Gene abbr：基因縮寫；FC1：基因在模型組的表達(dá)水平/基因在空白組的表達(dá)水平；FC2：基因在人迎組的表達(dá)水平/基因在模型組的表達(dá)水平。

3 討論

高血壓的普遍性和隨之帶來的并發(fā)癥的高風(fēng)險使之成為重要的公共衛(wèi)生問題[10]。在預(yù)防治療方面，大量的動物實驗和臨床研究報道了針刺治療高血壓的有效性[11-14]。因此本實驗以針刺人迎穴為研究平臺，采用基因芯片技術(shù)分析了干預(yù)后大鼠靶器官中整個基因組的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中存在著特殊而顯著的改變。在所獲得的372條差異表達(dá)基因中，上調(diào)基因129條，下調(diào)基因243條，其中課題組挑出了與模型組和人迎組密切相關(guān)的基因20條，按其作用和功能可將這些基因歸類，現(xiàn)就其中較重要的兩類分別進(jìn)行討論分析。

3.1 免疫方面的炎癥介導(dǎo)

炎癥已被公認(rèn)在高血壓和心血管疾病中發(fā)揮著重要的病理生理作用，它參與的許多過程均能使血壓升高。在病理狀況下，炎癥介質(zhì)能損傷血管內(nèi)皮的屏障功能致使血管通透性增高，增加了表面粘附因子的表達(dá)，同時也促進(jìn)了單核細(xì)胞的聚集粘附以及泡沫的形成，會導(dǎo)致大血管動脈粥樣硬化[15]。而在脈管系統(tǒng)中，炎癥可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖，在血管重構(gòu)中起著一定作用[16-18]。再者，腦部擁有許多復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，能通過神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)整交感-迷走神經(jīng)的平衡，從而調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)以及中心和周圍的血液流通[19]，因而與高血壓的治療密切相關(guān)。神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)方面，針灸效應(yīng)可能是通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)的，針刺人體特定穴位會直接或間接刺激神經(jīng)受體，通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)誘導(dǎo)內(nèi)分泌和體內(nèi)系統(tǒng)部分化學(xué)物質(zhì)的改變，引起一系列細(xì)胞免疫和體液免疫[20-21]。也有研究表明，針刺可以激活細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，而細(xì)胞的局部電活動，可能與細(xì)胞骨架或部分受體受到激活作用有關(guān)[22]。

在所挑選的20個基因中與高血壓密切相關(guān)的Klk1、5-HT1A、CBS、Ifit1、CD4、Pnpla1、Ppp2r4等基因在模型組下調(diào)的同時在人迎組上調(diào)，其中與炎癥方面相關(guān)的基因有CD4、Ifit1、KLk1。有研究表明[23-26]，CD4+、CD25+等因子的數(shù)量減少和(或)功能降低，與原發(fā)性高血壓的發(fā)病存在一定聯(lián)系，其發(fā)生的可能機制是針刺能刺激相應(yīng)感受器，促進(jìn)細(xì)胞因子及化學(xué)成分的產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，從而提高外周CD4的數(shù)量和功能，降低了炎癥細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血管周圍組織的滲透，同時減少了炎癥因子的產(chǎn)生，對高血壓起到一定的免疫治療作用[23，27]。基因Ifit1在功能分類上屬于調(diào)控蛋白，可以被IfN誘導(dǎo)產(chǎn)生，但其作用機制與CD4相類似，在一定程度上能促進(jìn)自身免疫中Th2的亞單位IL-4和IL-10細(xì)胞因子的分泌，從而增強體液免疫應(yīng)答，提高CD4含量[28]，達(dá)到免疫治療的效果。本實驗研究結(jié)果顯示，CD4和IfN在模型組表達(dá)下調(diào)的同時在人迎組表達(dá)上調(diào)，與這兩條基因的其他研究成果相一致，都說明了針刺人迎穴可抑制高血壓的發(fā)展。組織緩激肽釋放酶(kallikren-1,KLK1)由絲氨酸蛋白酶分解產(chǎn)生，是肥大細(xì)胞和血小板在最初的炎癥過程[29]。它能刺激產(chǎn)生和釋放炎性介質(zhì)，如粘附分子、細(xì)胞因子、前列腺素、一氧化氮和自由基等參與高血壓、炎癥、心血管疾病的內(nèi)穩(wěn)態(tài)等活動[30-31]。大量研究報道，KLK1可大范圍降低血壓[32]。結(jié)合的實驗結(jié)果顯示：與空白組相比，模型組大鼠的KLK1基因顯著減少，同時這也符合對高血壓患者的臨床研究，即高血壓時KLK1含量較低[33]，而針刺人迎穴可以增加基因KLK1的表達(dá)。有臨床研究也顯示針刺可以顯著降低下丘腦中細(xì)胞激素的水平[34]。以上研究結(jié)果均說明針灸具有抗高血壓類作用，其作用機制可能涉及促炎性細(xì)胞因子的抑制作用[35]。因此課題組推斷，人迎穴可以改善高血壓狀態(tài)，抑制基因的表達(dá)。

3.2 調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的核轉(zhuǎn)錄因子

PP2A可以雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，目前研究認(rèn)為它具有腫瘤抑制因子的潛在能力[36]。此抑制功能與對DNA損傷時的反應(yīng)和信號傳導(dǎo)，細(xì)胞生長分化的蛋白去磷酸化作用有關(guān)。PP2A有關(guān)功能是靠其家族的小亞群來實現(xiàn)的。而PPP2r4作為PP2A一個重要的亞單位[37-38]，在周期細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞調(diào)節(jié)和DNA復(fù)制時等有一定關(guān)系，其表達(dá)異?；蚧蛲蛔兊染赡苡绊懥苏＜?xì)胞的增殖。同為RNA轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的Pnpla1基因突變時由它介導(dǎo)的磷脂酶類的產(chǎn)生也會受到抑制，也就是會數(shù)量減少或功能降低，導(dǎo)致部分功能缺失、皮膚屏障受損，甚至可能致使大鼠過早死亡。在干預(yù)28天以后，基因Pnpla1在模型組大鼠表達(dá)下調(diào)，在人迎組表達(dá)上調(diào)，間接證實了針刺人迎穴對下丘腦中Pnpla1的表達(dá)有一定影響，從而對高血壓病情的發(fā)展有重要作用[39-41]。因此課題組推測，針刺人迎穴影響了多條基因在下丘腦中的表達(dá)，是其對心血管重構(gòu)和血壓調(diào)節(jié)影響的原因所在。

3.3 影響神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控

下丘腦擁有許多復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，它通過神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)中樞和周圍的血液流通。電生理學(xué)研究表明，下丘腦是心血管核心的重要組成部分，它通過不同的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控交感-迷走神經(jīng)的平衡來調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)[42]。

5-羥色胺受體是一種調(diào)節(jié)心血管反應(yīng)并且擁有176da生物單胺分子量的受體[43]。5-HT1A能激活腦干和脊髓，通過下行通路抑制交感神經(jīng)活性，降低血壓，減緩心率[44]。腦干中5-HT1A受體的激活引起強有力的選擇性抑制高血壓和交感神經(jīng)的反應(yīng)，刺激并誘發(fā)背內(nèi)側(cè)的下丘腦核團[45]。H2S是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生硫化氫的主要酶類,能調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)。硫化氫是一種內(nèi)皮依賴性血管舒張因子，它能改善周圍血管的舒張功能[46]。

本實驗數(shù)據(jù)顯示，與空白組相比，模型組大鼠體內(nèi)的基因5-HT1A和Cbs表達(dá)降低，人迎組干預(yù)后，5-HT1A和Cbs的表達(dá)明顯增多。這表明，針刺人迎穴可以調(diào)節(jié)基因5-HT1A和Cbs在SHR下丘腦內(nèi)的表達(dá)。在針灸領(lǐng)域，腦干中心血管相應(yīng)區(qū)域的軀體感覺神經(jīng)的誘發(fā)是通過一系列神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)活動的，基本上使神經(jīng)改變活動恢復(fù)到一個穩(wěn)定的基線水平[47]。因此課題組推測，針刺人迎穴可以影響5-HT1A和Cbs等興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中釋放，從而改變感覺信息傳遞的過程，最終降低血壓，使血壓和心血管功能正常化。

綜上所述，針刺人迎穴能明顯降低SHR的血壓，影響下丘腦中355條基因的表達(dá)，其中部分基因和原發(fā)性高血壓的病情發(fā)展密切相關(guān)。本實驗的創(chuàng)新點在于采用針刺人迎穴干預(yù)，利用基因芯片技術(shù)從基因?qū)用孢M(jìn)行研究；它可以在同一時間檢測大量基因的表達(dá)，正好適用于研究多基因影響的高血壓疾病，同時可以從分子水平全面而深刻的探明針刺的作用機制，符合了中醫(yī)治療疾病的整體觀念。根據(jù)本實驗結(jié)果推測，針刺人迎穴對抗原發(fā)性高血壓的可能機制是其影響了部分基因的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)炎癥、神經(jīng)遞質(zhì)及其受體、交感神經(jīng)興奮性等影響血管重構(gòu)以及其相關(guān)功能，從而對高血壓達(dá)到一定治療效果，并且為以后同方向的科研提供了思路和相關(guān)材料，對臨床也有較為可行的指導(dǎo)意義。下一步工作有必要對基因芯片分析獲得的差異表達(dá)基因做進(jìn)一步驗證。

[1] 陳廣勝，李立新，許迪，等.高血壓前期人群左室結(jié)構(gòu)和功能的改變:盲法評估及對照組比較[J].中國臨床康復(fù),2005,9(15)：80-81.

[2] Slama M, Susic D, Frohlich ED. Prevention of hypertension[J]. Current Opinion in Cardiology, 2002, 17(5):531-536.

[3] Franceschini N,Le TH.Invited Review-Genetics of Hypertension:discoveries from the bench to human populations [J].Am JPhysiol Renal Physiol,2014,306(1):1-11.

[4] 于正,吳巧鳳,梁繁榮,等. 針刺通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)治療原發(fā)性高血壓的機制探討[J].針刺研究,2014,39(4) : 333-336.

[5] 陳晶,劉寧,張毅杰,等. 血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與原發(fā)性高血壓[J].中國實用醫(yī)藥，2009, 4(23): 241-242.

[6] 靳聰妮,安玉蘭,張?zhí)焐?等.針刺降壓組穴治療輕中度高血壓病臨床療效觀察[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010,24(4):291-293.

[7] Wang J,Xiong X, Liu W. To systematically assess the current clinical evidence of acupuncture for essential hypertension[J]. Int J Cardiol,2013,169(5):317-326.

[8] 周逸平,王月蘭,方志斌,等.針刺對SHR血壓及NE、DA、5-HT含量的影響和血壓與血粘度的關(guān)系[J].針刺研究,2005,20(3)：55-61.

[9] Korostynski M, Piechota M, Golda S, et al. High-Throughput Gene Expression Profiling of Opioid-Induced Alterations in Discrete Brain Areas[J]. Methods in Molecular Biology, 2015,(1230):65.

[10] Yin C, Seo B, Park H J, et al. Acupuncture, a promising adjunctive therapy for essential hypertension: a double-blind, randomized, controlled trial[J]. Neurological Research, 2007, 29 Suppl 1(S1):98.

[11] Park JM, Shin AS, Park SU, et al. The acute effect of acupuncture on endothelial dysfunction in patients with hypertension: a pilot, randomized, double-blind, placebo-controlled crossover trial[J]. Journal of Alternative & Complementary Medicine, 2010, 16(8):883-888.

[12] Sugioka K,Mao W, Woods J,et al. An unsuccessful attempt to treat hypertension with acupuncture[J]. Am J Chin Med (Gard City NY), 1977,5(1): 39-44.

[13] Kalish LA, Buczynski B, Connell P, et al. Stop Hypertension with the Acupuncture Research Program (SHARP): clinical trial design and screening results[J]. Controlled Clinical Trials, 2004, 25(1):76-103.

[14] 王春,秦少博,李萍,等.H型高血壓患者炎癥水平與內(nèi)皮功能的關(guān)系研究[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2015,36(1)：89-92.

[15] Virdis A, Schiffrin E L. Vascular inflammation: a role in vascular disease in hypertension?[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2003, 12(2):181-187.

[16] Trott D W, Harrison D G. The immune system in hypertension[J]. Advances in Physiology Education, 2014, 38(1):20-24.

[17] Harrison D G, Guzik T J, Lob H E, et al. Inflammation, immunity, and hypertension[J]. Hypertension, 2011, 57(2):132-140.

[18] Chen H, Dai J, Zhang X, et al. Hypothalamus-Related Resting Brain Network Underlying Short-Term Acupuncture Treatment in Primary Hypertension[J]. Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM, 2013, (2):808971.

[19] 盧金花,王玲玲,姜勁峰,等.針灸對抑郁癥患者神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)影響研究[J].吉林中醫(yī)藥,2010,10(10)：893-895.

[20] 牛文民,牛曉梅,雷政權(quán),等.針灸足三里穴對神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的影響[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,3(2)：101-103.

[21] Bazzoni G, Dejana E. Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis[J]. Physiological Reviews, 2004, 84(3):869.

[22] Guzik T J, Hoch N E, Brown K A, et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction[J]. Journal of Experimental Medicine, 2007, 204(10):2449.

[23] Todryk S M, Gough M J, Pockley A G. Facets of heat shock protein 70 show immunotherapeutic potential[J]. Immunology, 2003, 110(1):1-9.

[24] Kovalenko A D. T regulatory lymphocytes prevent angiotensin II-induced hypertension and vascular injury[J]. Hypertension, 2011, 57(3):469.

[25] Bomfim G F, Echem C, Martins C B, et al. Toll-like receptor 4 inhibition reduces vascular inflammation in spontaneously hypertensive rats[J]. Life Sciences, 2015, (122):1.

[26] 楊子聰, 施瑩, 劉伶. CD4+T淋巴細(xì)胞亞群在原發(fā)性高血壓中作用的研究進(jìn)展[J]. 中國臨床新醫(yī)學(xué), 2016, 9(11):1038-1041.

[27] 李卓成, 羅蓉, 李延武. SLE相關(guān)基因IFIT1免疫調(diào)節(jié)功能的初步研究[J]. 深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2008, 18(5):265-269.

[28] Guevara-Lora I. Kinin-mediated inflammation in neurodegenerative disorders[J]. Neurochemistry International, 2012, 61(1):72-78.

[29] Naffahmazzacoratti M D G, Gouveia T L F, Sim?es P S R, et al. What have we learned about the kallikrein-kinin and renin-angiotensin systems in neurological disorders[J]. 世界生物化學(xué)雜志:英文版(電子版), 2014, 5(2):130-140.

[30] Pesquero J B, Bader M. Molecular biology of the kallikrein-kinin system: from structure to function[J]. Brazilian Journal of Medical & Biological Research, 1998, 31(9):1197-1203.

[31] Yu H Z, Xie L D, Zhu P L, et al. Human tissue kallikrein 1 gene delivery inhibits PDGF-BB-induced vascular smooth muscle cells proliferation and upregulates the expressions of p27 Kip1, and p2l Cip1[J]. Molecular & Cellular Biochemistry, 2012, 360(1-2):363-371.

[32] Ling L, Hou Q, Xing S, et al. Exogenous kallikrein enhances neurogenesis and angiogenesis in the subventricular zone and the peri-infarction region and improves neurological function after focal cortical infarction in hypertensive rats[J]. Brain Research, 2008, 1206(3):89-97.

[33] Lu J, Shaoa R H, Hub L, et al. Potential antiinflammatory effects of acupuncture in a chronic stress model of depression in rats[J]. Neuroscience Letters, 2016, (618):31.

[34] Wan F, Niu X, Song Y L, et al. The Role of Chinese Herbs and Acupuncture on the Inflammation Reaction After Cerebral Ischemia[J]. Current Pharmaceutical Design, 2016, 22(6):709.

[35] Virshup D M. Protein phosphatase 2A: a panoply of enzymes[J]. Current Opinion in Cell Biology, 2000, 12(2):180-185.

[36] Sontag E. Protein phosphatase 2A: the Trojan Horse of cellular signaling[J]. Cellular Signalling, 2001, 13(1):7-16.

[37] Goldberg Y. Protein phosphatase 2A: who shall regulate the regulator?[J]. Biochemical Pharmacology, 1999, 57(4):321-328.

[38] Csortos C,Zolnierowicz S, Bolo E, et al. High Complexity in the expression of the B subunit of protein phosphatase 2AO Evidence for the existence of at least seven novel isoforms[J].J Biol Chem,1996,271:2578-2588.

[39] Hirabayashi T, Anjo T, Kaneko A, et al. PNPLA1 has a crucial role in skin barrier function by directing acylceramide biosynthesis[J]. Nature Communications, 2017, 8:14609.

[40] Ohno Y, Kamiyama N, Nakamichi S, et al. PNPLA1 is a transacylase essential for the generation of the skin barrier lipid ω-O-acylceramide[J]. Nature Communications, 2017, (8):14610.

[41] Chen H, Dai J, Zhang X, et al. Hypothalamus-Related Resting Brain Network Underlying Short-Term Acupuncture Treatment in Primary Hypertension[J]. Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM, 2013, 2013(2):808971.

[42] Barnes N M, Sharp T. A review of central 5-HT receptors and their function[J]. Neuropharmacology, 1999, 38(8):1083-1152.

[43] Ramage A G, Villalón C M. 5-Hydroxytryptamine and cardiovascular regulation[J]. Trends in Pharmacological Sciences, 2008, 29(9):472-81.

[44] Horiuchi J, Wakabayashi S, Dampney R A. Activation of 5-hydroxytryptamine 1A receptors suppresses the cardiovascular response evoked from the dorsomedial hypothalamic nucleus.[J]. Hypertension, 2005, 46(1):173-179.

[45] Perna A F, Lanza D, Sepe I, et al. Hydrogen sulfide, a toxic gas with cardiovascular properties in uremia: how harmful is it?[J]. Blood Purification, 2011, 31(1-3):102-106.

[46] Longhurst J. Acupuncture’s cardiovascular actions: a mechanistic perspective[J]. Medical acupuncture, 2013, 25(2): 101-113.