大黃素通過自噬抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移

權(quán) 彥,李小蓉,趙忠孝,劉靖麗,張 朋

(陜西中醫(yī)藥大學(xué),咸陽 712046)

動(dòng)脈粥樣硬化是引起心腦血管疾病死亡的主要原因。血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖與遷移在動(dòng)脈粥樣硬化形成中起著關(guān)鍵作用[1]。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇、丹參和黃芪甲苷等[2]均可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖遷移。

大黃素(emodin)是存在于大黃屬、蓼屬、鼠李屬植物和番瀉葉中的游離型蒽醌類成分,具有多種藥理作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),大黃素具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用[5]。郭丹杰等[6]首次提出中藥純品大黃素劑量依賴性抑制兔髂動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖。文獻(xiàn)證實(shí)大黃素對(duì)家兔離體主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用存在明顯質(zhì)量濃度依賴性[7-8]。然而，大黃素對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈VSMC增殖遷移作用還未被闡明。

細(xì)胞自噬(autophagy) 是一種維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的機(jī)制[9]。近年來較多研究集中在自噬與增殖遷移調(diào)控的關(guān)系上[10]。目前發(fā)現(xiàn)自噬激活對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞和舌鱗癌細(xì)胞的增殖遷移均具有抑制作用[11]。雷帕霉素抑制SD大鼠的腹主動(dòng)脈離體血管平滑肌細(xì)胞增殖與自噬激活有關(guān)[12]。目前,關(guān)于自噬在大黃素對(duì)細(xì)胞增殖遷移抑制過程中的作用報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)以大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象,研究大黃素對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移的抑制作用并初步探討其作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；全波段酶標(biāo)儀,SDSPAGE微型凝膠電泳儀,化學(xué)發(fā)光成像儀,Quantity One Software圖像分析系統(tǒng)(均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.2試藥 大黃素由陜西賽德高科技生物股份公司提供,經(jīng)HPLC鑒定質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%；DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清(美國Gibco公司)；3-甲基腺嘌呤(3-MA) (德國Sigma 公司)；LC3,Beclin1,PCNA和β-actin抗體 (美國Cell Signaling Technology公司)；CCK8試劑盒(日本同仁會(huì)社)；HRP(美國 Santa Cruz公司)。

1.3動(dòng)物 健康雄性 SD大鼠,體質(zhì)量為150～200 g,購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)：SYXK(陜)2014-003。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 選取體質(zhì)量為150～200 g的健康雄性SD大鼠,腹腔注射麻醉藥。取大鼠胸腹主動(dòng)脈,剔除外周結(jié)締組織,用預(yù)冷的PBS沖洗3次后,剝離血管中膜層,剪碎,貼塊法培養(yǎng)VSMC,整個(gè)操作過程保持無菌。細(xì)胞在含100 mL·L-1胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、100 U·mL-1青霉素和100 [μg·mL-1]鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和37 ℃條件下培養(yǎng),取3～7代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[13]。

2.2CCK8法 取對(duì)數(shù)生長期大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞,制成單細(xì)胞混合液,調(diào)整密度為1×104個(gè)·mL-1,接種于96孔板,每孔含200 μL細(xì)胞混懸液,設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度生長至60%～80%時(shí),分別加入含不同質(zhì)量濃度大黃素(0,5,10,20,40和80 μg·mL-1)的DMEM(含10 mL·L-1FBS) 200 μL刺激細(xì)胞,同時(shí)設(shè)空白調(diào)零組(不加細(xì)胞僅加入等量的DMEM)及TGF-β1(5[ng·mL-1)]刺激的陽性藥物組。藥物處理24 h后每孔加入CCK8溶液,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育 2 h。用酶標(biāo)儀于450 nm波長條件下測定吸光度值A(chǔ),計(jì)算細(xì)胞抑制率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A450值-空白調(diào)零組A450值)/(對(duì)照組A450值-空白調(diào)零組A450值)]×100%

2.3劃痕實(shí)驗(yàn)法 將對(duì)數(shù)生長期的VSMC消化混勻?yàn)?×104個(gè)·mL-1細(xì)胞混懸液,接種1 mL于24孔板,在含10 mL·L-1FBS的 DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞至90%～95%混合。用200 μL無菌槍頭在孔中劃出直徑為3 mm的平直劃痕,PBS 沖洗后換含不同質(zhì)量濃度大黃素(0,5,10,20,40和80 μg·mL-1)的DMEM及TGF-β1(5 ng·mL-1)刺激的陽性藥物,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下觀察劃痕情況,拍照，每個(gè)孔至少拍照3個(gè)點(diǎn),每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2.4蛋白印跡法 各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)給藥處理后,預(yù)冷PBS漂洗2次,每孔加入150 μL RIPA 和 1 μL PMSF,冰上裂解20 min,以12 000 r·min-1離心15 min,吸取上清液。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測。熱變性后,取30 μg總蛋白在聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離,電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,0.5 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉4 h。一抗(LC3II/I,Beclin-1,PCNA和β-actin)4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng) IgG二抗(工作液質(zhì)量濃度為1∶5 000)室溫孵育1～2 h。最后將漂洗后的PVDF膜上加發(fā)光底物顯影液曝光顯影,置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。用Quantity One 4.31凝膠蛋白分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1不同質(zhì)量濃度大黃素對(duì)VSMC增殖的影響 CCK8法和免疫印跡法檢測不同質(zhì)量濃度大黃素對(duì)VSMC增殖的影響,應(yīng)用不同質(zhì)量濃度(5,10,20,40和80 μg·mL-1)大黃素刺激VSMC 24 h。CCK8法結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,TGF-β1(5 ng·mL-1)可明顯促進(jìn)VSMC增殖,而大黃素可抑制VSMC增殖,隨著質(zhì)量濃度增加抑制率顯著增加,在質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1時(shí)抑制作用最明顯,抑制率達(dá)50.9%～60.6%。同時(shí),采用免疫印跡法檢測增殖蛋白PCNA的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),大黃素呈質(zhì)量濃度依賴性抑制VSMC中增殖蛋白PCNA的表達(dá),且在質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1時(shí)抑制效果最強(qiáng),質(zhì)量濃度為80 μg·mL-1時(shí)抑制率有所下降,可能與其高質(zhì)量濃度導(dǎo)致細(xì)胞死亡有關(guān)。見圖1。

圖1不同質(zhì)量濃度大黃素對(duì)VSMC增殖的影響

A.CCK8法檢測細(xì)胞抑制率；B.免疫印跡法檢測PCNA蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01。

Fig.1 The effect of emodin on the proliferation of VSMC

1.the cell viability determined by CCK8 assay；B.the protein expression of PCNA determined by Western Blotting.*P<0.05,**P<0.01 vs the control group.

3.2不同質(zhì)量濃度大黃素對(duì)VSMC遷移的影響 采用劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測不同質(zhì)量濃度大黃素對(duì)VSMC遷移的影響。結(jié)果見圖2。由圖2可知，TGF-β1(5 ng·mL-1)可明顯促進(jìn)VSMC遷移,而隨著大黃素質(zhì)量濃度依次增加,劃痕愈合程度明顯減弱,各質(zhì)量濃度組細(xì)胞遷移率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明,大黃素可質(zhì)量濃度依賴性地抑制VSMC的遷移,且質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞抑制率最低。

圖2不同質(zhì)量濃度大黃素對(duì)VSMC遷移的影響

A.各組24 h細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)圖片；B.各組24 h細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)遷移率。劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測細(xì)胞遷移。與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01。

Fig.2 The effect of emodin on the migration of VSMC

A.24 h cell scratch test pictures in each group; B.Migration rate of scratch test of 24 h cells in each group.The migration determined by wound healing assay.*P<0.05,**P<0.01 vs the control group.

3.3不同質(zhì)量濃度大黃素對(duì)VSMC自噬的影響 為初步探討細(xì)胞自噬是否參與大黃素對(duì)VSMC細(xì)胞增殖遷移的調(diào)控過程,應(yīng)用不同質(zhì)量濃度大黃素刺激VSMC細(xì)胞24 h后,提取細(xì)胞總蛋白,免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的表達(dá)。與對(duì)照組比較,TGF-β1可明顯促進(jìn)VSMC自噬蛋白LC3和Beclin1的表達(dá),且隨著大黃素質(zhì)量濃度增加,LC3和Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng),結(jié)果表明,大黃素抑制VSMC增殖遷移過程中,可質(zhì)量濃度依賴性地上調(diào)細(xì)胞自噬。見圖3。

圖3不同質(zhì)量濃度大黃素對(duì)VSMC細(xì)胞自噬的影響

A.免疫印跡法檢測LC3蛋白表達(dá)水平；B.免疫印跡法檢測Beclin1蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01。

Fig.3 The effect of emodin on the autophagy of VSMC

A.the protein expression of LC3 determined by Western Blotting；B.the protein expression of Beclin1determined by Western Blotting.*P<0.05,**P<0.01 vs the control group.

3.4大黃素通過細(xì)胞自噬抑制VSMC的增殖 為進(jìn)一步研究大黃素是否通過細(xì)胞自噬抑制VSMC的增殖遷移。我們采用自噬抑制劑3-MA(5 mM)預(yù)處理細(xì)胞1 h,40 μg·mL-1大黃素刺激細(xì)胞24 h。見圖4。CCK8法結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,40 μg·mL-1大黃素明顯抑制VSMC增殖；而與40 μg·mL-1大黃素處理組比較,3-MA預(yù)處理后,大黃素對(duì)VSMC的抑制作用明顯減弱,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫印跡法檢測增殖蛋白PCNA的表達(dá)水平,其變化與CCK8法檢測結(jié)果一致。

3.5大黃素通過細(xì)胞自噬抑制VSMC的遷移 研究采用自噬抑制劑3-MA(5 mM)預(yù)處理細(xì)胞1 h,40 μg·mL-1大黃素刺激細(xì)胞24 h。見圖5。與單獨(dú)40 μg·mL-1大黃素處理組比較,抑制細(xì)胞自噬后,大黃素對(duì)VSMC的遷移抑制作用明顯減弱。綜上所述,大黃素抑制VSMC的增殖遷移作用是通過細(xì)胞自噬實(shí)現(xiàn)的。

圖4大黃素通過細(xì)胞自噬抑制VSMC的增殖

A.CCK8法檢測細(xì)胞抑制率；B.免疫印跡法檢測PCNA蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01；與大黃素組比較#P<0.05。

Fig.4 Emodin inhibits the proliferation of VSMC through autophagy

A.the cell viability determined by CCK8 assay；B.the protein expression of PCNA determined by Western Blotting.*P<0.05,**P<0.01 vs the control group;#P<0.05 vs the emodin group.

圖5大黃素通過細(xì)胞自噬抑制VSMC的遷移

A.各組24 h細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)圖片；B.各組24 h細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)遷移率。劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測細(xì)胞遷移。與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01;與大黃素組比較#P<0.05。

Fig.5 Emodin inhibits the proliferation of VSMC through autophagy

A.24 h cell scratch test pictures in each group; B.Migration rate of scratch test of 24 h cells in each group.The migration determined by wound healing assay.*P<0.05,**P<0.01 vs the control group;#P<0.05 vs the emodin group.

4 討論

VSMC的增殖遷移可能是造成動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn),多酚類化合物原花青素能夠顯著抑制VSMC的增殖與遷移。據(jù)報(bào)道,大黃素對(duì)某些以細(xì)胞增殖、遷移及凋亡為主要病理改變的疾病具有潛在的治療作用[14]。大黃素可有效抑制大鼠膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、人胰腺癌Panc-1細(xì)胞等生長及高糖誘導(dǎo)的大鼠 GMC增殖等。據(jù)此,我們首次采用原代培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈VSMC對(duì)大黃素增殖遷移的作用進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著大黃素給藥質(zhì)量濃度的增加,其對(duì)VSMC的增殖和遷移的抑制作用逐漸增強(qiáng)。表明大黃素呈質(zhì)量濃度依賴性抑制VSMC的增殖遷移,其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

基礎(chǔ)水平的血管平滑肌細(xì)胞自噬[15]延緩動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)程,提示細(xì)胞自噬可能參與調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移[16]。觀察不同質(zhì)量濃度大黃素抑制VSMC增殖遷移作用的過程中,細(xì)胞自噬水平上調(diào)。此結(jié)果與張佩佩等提出的雷帕霉素的抑制VSMC增殖作用與自噬激活有關(guān)結(jié)論一致。研究再采用自噬特異性抑制劑3-MA抑制自噬。結(jié)果顯示,單獨(dú)40 μg·mL-1大黃素可抑制細(xì)胞增殖[17-18],3-MA預(yù)處理VSMC后大黃素對(duì)VSMC增殖遷移的抑制作用明顯減弱,說明大黃素抑制VSMC的增殖遷移是通過細(xì)胞自噬完成。

綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)大黃素可通過細(xì)胞自噬抑制VSMC的增殖遷移。由此可知,大黃素對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化性及血管狹窄等血管病變的發(fā)生發(fā)展具有臨床價(jià)值,本研究對(duì)于研究自噬在細(xì)胞增殖遷移中的調(diào)控也具有重要意義。

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