單硝酸異山梨酯緩釋片對(duì)慢性高原病大鼠模型睪丸的保護(hù)作用

王 磊,陳施展,買爾哈巴·吐爾遜,李麗丹,劉峻甫,謝孟君,艾尼娃爾·艾克木

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)厚博學(xué)院,克拉瑪依 834000；3.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,烏魯木齊 830011；4.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830011)

在哺乳動(dòng)物中,循環(huán)系統(tǒng)的血流壓力驅(qū)動(dòng)氧氣到達(dá)機(jī)體各組織中。引起低氧的原因有：機(jī)體器官或組織與外界環(huán)境的氧氣交換減少、血管床減少、大氣環(huán)境氧分壓降低和水生環(huán)境氧含量下降等情況。低氧影響機(jī)體正常的生長發(fā)育,甚至導(dǎo)致某些器官、組織、細(xì)胞或亞細(xì)胞水平功能障礙或損傷[1-2]。機(jī)體在低氧狀態(tài)下,常常優(yōu)先保障心腦等重要器官的血供,而睪丸的血供通常會(huì)顯著下降,睪丸組織和細(xì)胞常常出現(xiàn)損傷[3]。近年來,隨著生活質(zhì)量的提高,長期工作和生活在高原的平原移居者生殖機(jī)能方面的改變開始備受關(guān)注。

單硝酸異山梨酯緩釋片(Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets)通過擴(kuò)張全身血管和冠狀血管來改善心肌耗氧量和心臟血供,常用于治療低氧環(huán)境下的冠心病和心絞痛[4]。本課題組發(fā)現(xiàn)單硝酸異山梨酯緩釋片對(duì)大鼠受損睪丸具有一定的保護(hù)作用,但相關(guān)報(bào)道不多。高原低氧引起的低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)較常見,HPH是慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)發(fā)病的重要病理生理變化。本實(shí)驗(yàn)通過建立CMS大鼠模型,以HPH和睪丸相關(guān)病理切片作為CMS大鼠模型造模的指標(biāo),研究單硝酸異山梨酯緩釋片對(duì)CMS大鼠的PAP、IL-6、CRP、MDA、SOD和GSH-PX等指標(biāo)的影響,旨在探討單硝酸異山梨酯緩釋片對(duì)CMS大鼠模型睪丸的保護(hù)作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 TDL80-2B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；LEICA RM 2016石蠟切片機(jī)(上海五相儀器儀表有限公司)。

1.2試藥 單硝酸異山梨酯緩釋片(英國Astrazeneca公司,批號(hào)1206085)；硝苯地平片(山西云鵬制藥有限公司,批號(hào)C120304)；大鼠白介素-6試劑盒(美國eBioscience公司,批號(hào)74350026)；大鼠C-反應(yīng)蛋白試劑盒(上海西唐生物科技有限公司,批號(hào)3400630)；大鼠超氧化物歧化酶試劑盒、大鼠丙二醛試劑盒和大鼠谷胱甘肽-過氧化氫酶試劑盒(批號(hào)：20130410,20130409,20130401),均購自南京建成生物工程研究所。

1.3動(dòng)物 正常SD大鼠60只,體質(zhì)量160～200 g,均為新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCKK(新)2011-0004)。

2 方法

2.1CMS大鼠造模 在西北地區(qū)平時(shí)和戰(zhàn)時(shí)衛(wèi)勤保障人工實(shí)驗(yàn)艙造模,該艙條件：模擬海拔5 000 m,壓力54.1 kPa,氧分壓10.84 kPa,溫度范圍18～26 ℃,濕度范圍40%～60%。每日定時(shí)觀察大鼠的攝食、飲水、毛發(fā)、糞便和行為等狀況以及眼、耳、鼻、口有無分泌物,定時(shí)稱定體質(zhì)量。整個(gè)操作過程在30 min內(nèi)完成。30 d后,進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)及實(shí)施均由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(審批號(hào)：IACUC-20130217063)。

2.2SD大鼠肺動(dòng)脈壓的測定 SD大鼠采用仰臥位固定,剪開頸部、胸部外皮,隨后沿著胸骨的正中線打開胸腔,暴露心臟和肺。肺動(dòng)脈壓力通過充滿肝素化的生理鹽水的針頭插入肺動(dòng)脈來測量,肉眼可視針頭的位置。針頭的另一端利用壓力換能器和自制導(dǎo)管相連,將壓力變化的數(shù)據(jù)用生物信號(hào)記錄儀記錄。

2.3SD大鼠睪丸病理學(xué)的檢查方法 (1)SD大鼠睪丸蠟塊標(biāo)本的制備。取下左側(cè)睪丸,用生理鹽水清洗3次,沿睪丸縱向中部切開,去除睪丸脂肪、附著精膜及上下兩側(cè)部分組織,用100 mL·L-1甲醛固定,將上述固定的組織標(biāo)本按順序依次置于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中3 h、體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇中2 h、體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇中1.5 h、乙醇中2 h和無水乙醇中1 h；再置于二甲苯中透明處理30 min；在低熔點(diǎn)石蠟中浸潤3 h,使浸潤標(biāo)本在室溫下凝固為蠟塊標(biāo)本。(2)SD大鼠睪丸組織切片的制備。將蠟塊標(biāo)本制成4 μm切片,按順序在體積分?jǐn)?shù)為30%～40%的乙醇和38 ℃的水中展開,使用載玻片撈取切片,將取到切片的載玻片放入37 ℃烘箱中12 h,室溫保存。(3)組織切片常規(guī)HE染色。將石蠟切片連續(xù)3次置于二甲苯中各進(jìn)行15 min脫蠟；連續(xù)2次置于無水乙醇中2 min,乙醇中2 min,體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇中2 min和蒸餾水中沖洗；置于蘇木精中染色6 min,用蒸餾水沖洗；置于1 mL·L-1鹽酸乙醇液中分色數(shù)秒,用蒸餾水沖洗；置于5 mL·L-1氨水中返藍(lán),用蒸餾水沖洗3次；再置于伊紅染液中數(shù)秒,用蒸餾水沖洗；最后依次置于體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇中數(shù)秒,乙醇中數(shù)秒,無水乙醇中2 min脫水。在64 ℃溫箱內(nèi)干燥10 min,再滴加中性樹膠,蓋好蓋玻片,晾干封固。用普通光學(xué)顯微鏡觀察睪丸組織細(xì)胞的形態(tài)變化。

2.4SD大鼠血清學(xué)指標(biāo)的測定 將實(shí)驗(yàn)SD大鼠隨機(jī)分成6組,每組10只,其中5組進(jìn)行CMS造模。造模30 d后,根據(jù)體質(zhì)量進(jìn)行干預(yù)。①單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組：給予單硝酸異山梨酯緩釋片3.239 8 mg,每日1次,灌胃15 d；②單硝酸異山梨酯緩釋片中劑量組：給予單硝酸異山梨酯緩釋片1.619 9 mg,每日1次,灌胃15 d。③單硝酸異山梨酯緩釋片低劑量組：給予單硝酸異山梨酯緩釋片0.809 9 mg,每日1次,灌胃15 d。④陽性對(duì)照組：給予硝苯地平2.7 mg,每日1次,連續(xù)灌胃15 d。⑤高原模型組：使用等量生理鹽水灌胃,每日1次；⑥正常對(duì)照組：不采取任何干預(yù)措施且未造模。以上各組連續(xù)干預(yù)15 d后,取氯胺酮(50 mg·mL-1)、地西泮(5 mg·mL-1)和阿托品(0.5 mg·mL-1)各1支的液體混合物,稀釋1倍,按照0.007 5 mL·g-1對(duì)實(shí)驗(yàn)SD大鼠腹腔注射麻醉,再腹主動(dòng)脈采血,室溫下放置30 min,用低溫離心機(jī)以3 000 r·min-1離心20 min,取上清液,用相應(yīng)的試劑盒測定IL-6和CRP指標(biāo)。

2.5SD大鼠睪丸勻漿后指標(biāo)的測定 取大鼠左側(cè)睪丸,置于生理鹽水中清洗3次,沿睪丸縱向中部切開,去除睪丸脂肪、附著精膜以及上下兩側(cè)部分組織,用天平稱定質(zhì)量,將所需部分移至燒杯中,向其中加入適量預(yù)冷的生理鹽水,用相應(yīng)器具在低溫下剪碎標(biāo)本,后用組織勻漿器勻漿15 min,再用低溫離心機(jī)以3 500 r·min-1離心15 min,取上清液,檢測SOD、MDA和GSH-PX。

2.6數(shù)據(jù)處理 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0,所有相關(guān)數(shù)據(jù)均作方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn),采用χ2檢驗(yàn)和單因素方差分析。用方差分析來進(jìn)行組間比較,當(dāng)P<0.05時(shí),組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)比較 ①正常對(duì)照組：在低、高倍鏡下均可見睪丸組織結(jié)構(gòu)未見異常,無病變,精細(xì)胞多。②高原模型組：最明顯的病變是間質(zhì)充血以及血管出血,次級(jí)精母細(xì)胞水腫,體質(zhì)縮小,精細(xì)胞變性,結(jié)構(gòu)不清。③陽性對(duì)照組：最明顯的病變是次級(jí)精母細(xì)胞腫脹變性,間質(zhì)有輕度充血。④單硝酸異山梨酯緩釋片低劑量組：血管擴(kuò)張,精細(xì)胞較少,可見次級(jí)精母細(xì)胞腫脹。⑤單硝酸異山梨酯緩釋片中劑量組：血管擴(kuò)張充血,精細(xì)胞少。⑥單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組：無充血,初級(jí)精母細(xì)胞腫脹偶見,精細(xì)胞數(shù)量有所恢復(fù)。見圖1。

3.2大鼠PAP的變化 高原模型組、陽性對(duì)照組和單硝酸異山梨酯緩釋片中、低劑量組與正常對(duì)照組比較,PAP有所上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組與正常對(duì)照組比較,PAP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與高原模型組比較,陽性對(duì)照組、單硝酸異山梨酯緩釋片各劑量組PAP有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽性對(duì)照組和單硝酸異山梨酯緩釋片高、中、低劑量組均可降低CMS大鼠的PAP。其中單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組的改善作用最好,優(yōu)于陽性對(duì)照組,其結(jié)果基本接近正常對(duì)照組的水平。見表1。

3.3大鼠睪丸血清中CRP和IL-6水平的變化 高原模型組、陽性對(duì)照組、單硝酸異山梨酯緩釋片各劑量組中的CRP和IL-6與正常對(duì)照組比較均有所上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽性對(duì)照組和單硝酸異山梨酯緩釋片各劑量組中的CRP和IL-6與高原模型組比較有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽性對(duì)照組和單硝酸異山梨酯緩釋片高、中、低劑量組均可降低CMS大鼠的CRP和IL-6水平。其中單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組對(duì)指標(biāo)CRP和IL-6的改善作用最好,優(yōu)于陽性對(duì)照組。見表2。

圖1大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)比較

A.正常對(duì)照組 (×100)；B.正常對(duì)照組 (×400)；C.高原模型組 (×100)；D.高原模型組 (×400)；E.陽性對(duì)照組 (×100)；F.陽性對(duì)照組 (×400)；G.單硝酸異山梨酯緩釋片低劑量組 (×100)；H.單硝酸異山梨酯緩釋片低劑量組 (×400)；I.單硝酸異山梨酯緩釋片中劑量組 (×100)；J.單硝酸異山梨酯緩釋片中劑量組 (×400)；K.單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組 (×100)；L.單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組 (×400)。

Fig.1 Comparison of morphology of testis in rats

A.blank control group (×100)；B.blank control group (×400)；C.high altitude group (×100)；D.high altitude group (×400)；E.positive control group (×100)；F.positive control group (×400)；G.low dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×100)；H.low dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×400)；I.medium dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×100)；J.medium dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×400)；K.high dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×100)；L.high dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×400).

表1各組實(shí)驗(yàn)大鼠肺動(dòng)脈壓的變化

Tab.1 Changes in the pulmonary arterial pressure of rats in each group (n=10,±s)

注：*P<0.05表示與正常對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；▲P<0.05表示與高原模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4單硝酸異山梨酯緩釋片對(duì)大鼠睪丸勻漿中SOD、MDA和GSH-PX等指標(biāo)的影響 高原模型組、陽性對(duì)照組和單硝酸異山梨酯緩釋片低劑量組中的SOD水平與正常對(duì)照組比較有所下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而單硝酸異山梨酯緩釋片中、高劑量組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高原模型組比較,陽性對(duì)照組和單硝酸異山梨酯緩釋片各劑量組的SOD水平均有所上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組對(duì)指標(biāo)SOD的改善作用最好,優(yōu)于陽性對(duì)照組。

表2大鼠血中CRP和IL-6水平的變化

Tab.2 Changes of levels of CRP and IL-6 in the sera of rats (n=10,±s)

注：*P<0.05表示與正常對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；▲P<0.05表示與高原模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與正常對(duì)照組比較,高原模型組、陽性對(duì)照組和單硝酸異山梨酯緩釋片低劑量組中的MDA水平上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而單硝酸異山梨酯緩釋片中、高劑量組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高原模型組比較,陽性對(duì)照組和單硝酸異山梨酯緩釋片各劑量組的MDA水平有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組對(duì)指標(biāo)MDA的改善作用最好,優(yōu)于陽性對(duì)照組。

與正常對(duì)照組比較,高原模型組、陽性對(duì)照組和單硝酸異山梨酯緩釋片低、中劑量組的GSH-PX水平下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高原模型組比較,陽性對(duì)照組和單硝酸異山梨酯緩釋片各劑量組的GSH-PX水平有上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組對(duì)指標(biāo)GSH-PX的改善作用最好,優(yōu)于陽性對(duì)照組。見表3。

表3各組實(shí)驗(yàn)大鼠勻漿中SOD、MDA和GSH-PX水平的變化

Tab.3 Changes of levels of SOD,MDA and GSH-PX in the homogenate organization in rats′ testis (n=10,±s)

注：*P<0.05表示與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；▲P<0.05表示與高原模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

肺血管阻力增加是HPH發(fā)病的中心環(huán)節(jié),以肺動(dòng)脈收縮反應(yīng)增強(qiáng)和平滑肌細(xì)胞增生為主要特征的肺血管結(jié)構(gòu)重建是HPH發(fā)病的主要病理變化[5]。大多數(shù)哺乳動(dòng)物的陰囊溫度比機(jī)體核心溫度低2～7 ℃,睪丸位于陰囊內(nèi),精子產(chǎn)生所需的血氧供應(yīng)與機(jī)體其他部位的血氧調(diào)節(jié)變化是相對(duì)獨(dú)立的,因此機(jī)體能夠很好地控制睪丸微環(huán)境,但若長期暴露于低氧環(huán)境,睪丸組織營養(yǎng)物質(zhì)、血流量和氧氣供應(yīng)量等可能發(fā)生變化,這些變化會(huì)對(duì)睪丸功能產(chǎn)生不良影響,進(jìn)而導(dǎo)致雄性生育能力低下或不育[6]。本課題研究發(fā)現(xiàn),高原模型組的PAP明顯高于正常對(duì)照組,且高原模型組的睪丸病理切片能顯示間質(zhì)充血以及血管出血,次級(jí)精母細(xì)胞水腫,體質(zhì)縮小,精細(xì)胞變性,結(jié)構(gòu)不清,提示CMS條件下的睪丸造模良好。

氧自由基又稱活性氧族(Reactive free species,ROS),是一種具有多種生物學(xué)功能且有雙重作用的介質(zhì)[7-8]。正常機(jī)體都會(huì)產(chǎn)生許多有害的自由基,但由于機(jī)體存在強(qiáng)大的抗氧化防御系統(tǒng),該系統(tǒng)可有效清除ROS及其代謝產(chǎn)物,在正常新陳代謝狀態(tài)下,該系統(tǒng)能夠維持機(jī)體自由基的形成和去除達(dá)到動(dòng)態(tài)的平衡,因此很難監(jiān)測到整個(gè)正常機(jī)體受到氧化損傷或破壞[9],這對(duì)維持生精過程有重要的意義[10-11]。機(jī)體的抗氧化能力直接受抗氧化酶活性高低的影響,抗氧化酶主要為SOD和GSH-PX等。SOD和GSH-PX對(duì)ROS的清除起重要作用[12]。SOD通過與MDA相互配合測定,機(jī)體清除氧自由基的程度可由SOD的活力大小來衡量,機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生狀況以及受自由基的攻擊程度可通過MDA的大小來判斷[13]。測定GSH-PX的活力可作為衡量機(jī)體氧化應(yīng)激水平的一項(xiàng)生化指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),模型組的SOD和GSH-PX水平低于正常對(duì)照組,MDA水平高于正常對(duì)照組,說明模型組大鼠清除自由基能力減弱,且機(jī)體細(xì)胞受到一定程度的自由基攻擊。而給予單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組的SOD、MDA和GSH-PX水平接近正常對(duì)照組,且優(yōu)于陽性對(duì)照組,說明單硝酸異山梨酯緩釋片對(duì)CMS大鼠模型的睪丸組織細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfacto-κB,NF-κB)的表達(dá)受低氧誘導(dǎo),機(jī)體炎癥反應(yīng)的調(diào)控源于NF-κB[14]。支持細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-6一方面能在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,另一方面在維持和調(diào)節(jié)睪丸局部的相關(guān)環(huán)境以及機(jī)體生殖功能等方面也有著重要的生理作用[15]。CRP是一種對(duì)組織感染、損傷和壞死等刺激因素都能較快發(fā)生反應(yīng)的蛋白,炎癥和組織損傷程度以及相關(guān)的治療反應(yīng)等情況都可使用CRP大小來進(jìn)行評(píng)估[16-19]。研究發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組比較,高原模型組的CRP和IL-6水平均明顯上升,說明CMS大鼠的睪丸組織細(xì)胞已產(chǎn)生一定的炎癥,而單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量組對(duì)指標(biāo)CRP和IL-6的改善作用較好,接近陽性對(duì)照組,且水平值優(yōu)于陽性對(duì)照組,提示單硝酸異山梨酯緩釋片具有間接抗炎癥反應(yīng)作用。

綜上所述,CMS大鼠的PAP水平升高,且睪丸病理切片出現(xiàn)間質(zhì)充血以及血管出血,提示CMS大鼠造模成功,其睪丸受到一定程度的損傷。CMS大鼠經(jīng)過單硝酸異山梨酯緩釋片高劑量干預(yù)后,可有效降低CMS大鼠的PAP、CRP和IL-6水平,提高睪丸的SOD和GSH-PX水平,降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的水平,清除氧自由基,同時(shí),睪丸病理切片亦出現(xiàn)相應(yīng)改善。單硝酸異山梨酯緩釋片對(duì)CMS大鼠模型睪丸有一定的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單硝酸異山梨酯緩釋片是常用的心血管類藥物,本課題從睪丸研究的角度,觀察和評(píng)價(jià)其相關(guān)的藥理作用,實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)藥的新研究。

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