鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒的毒性研究

王 盟,田寶成,田桂芹,商林林,張長遠 ,趙亞鑫

(1.濟寧市第一人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)部,濟寧 272000；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,煙臺 264000；3.濟寧市傳染病醫(yī)院藥劑科,濟寧 272000；4.濟寧市第二人民醫(yī)院藥劑科,濟寧 272000)

鉤藤為茜草科植物鉤藤的帶鉤莖枝,具有鎮(zhèn)靜、降壓、清熱平肝、息風定驚的功能,是治療心腦血管疾病的首選藥材之一,臨床上有著悠久的應(yīng)用歷史。[1-2]。鉤藤堿(Rhy)為鉤藤的有效成分之一,能夠抑制外周血管收縮,使血管阻力降低,血壓降低,同時有抗血小板聚集和抗血栓的作用[3-4]。筆者利用現(xiàn)代納米技術(shù)將鉤藤堿制成固體脂質(zhì)納米粒(Rhy-SLN),為進一步確定其毒性及毒性靶器官,本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上,進行了鉤藤堿固體脂質(zhì)納米粒對大鼠的長期毒性實驗研究,并與鉤藤堿緩釋滴丸[5](Rhy-SDP)的毒性進行了比較。

1 儀器與材料

1.1儀器 JA2003N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；DDL-6型低速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)；BC-3000血液分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司)；TBA-40 FR型全自動生化分析儀(日本東芝有限公司)。

1.2試藥 Rhy-SLN(批號20161012)，Rhy-SDP(批號20150423)，均為實驗室自制。

1.3動物 SPF級Wistar大鼠,體質(zhì)量為140～170 g,雌雄各半,由濟寧醫(yī)學(xué)院動物中心提供,動物合格證號：20030011。動物飼養(yǎng)條件：動物室為普通級,室溫：25 ℃,相對溫度：40%,通風、光照良好,采用標準飼料喂養(yǎng)。雌雄分籠飼養(yǎng),每籠5只,自由飲水[6]。

2 方法

2.1Rhy-SLN的制備 精密稱取處方量的鉤藤堿、脂質(zhì)、卵磷脂(8 mg∶80 mg∶100 mg)溶于適量的無水乙醇中,于75 ℃水浴下形成有機相。另取處方量的F-68溶于相同溫度的水中,保溫,構(gòu)成水相。將油相緩慢滴加到高速旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速1 000 r·min-1)的水相中。攪拌2 h,濃縮體積至原來的1/2。將所得的半透明體系快速分散于冰水中,繼續(xù)攪拌2 h,過0.45 μm微孔濾膜,即得。

2.2急性毒性實驗 將小鼠禁食16 h后,按體質(zhì)量隨機分為11組,每組10只,雌雄各半,1～5組灌胃不同劑量的Rhy-SDP(1 420,1 825,2 245,2 965和3 347 mg·kg-1)混懸液,6～10組灌胃不同劑量(1 280,1 600,2 000,2 500和3 125 mg·kg-1)的Rhy-SLN混懸液,空白組給予小鼠體積分數(shù)為0.5%的CMC-Na,灌胃量均為0.02 mL·g-1。即刻觀察各組出現(xiàn)的毒性反應(yīng),連續(xù)觀察14 d,記錄動物的毒性反應(yīng)及死亡情況[7-8 ]。

2.3長期毒性實驗 將大鼠禁食16 h后,按照體質(zhì)量隨機分為為空白對照組(蒸餾水)、Rhy-SLN高劑量組(80 mg·kg-1)、Rhy-SLN低劑量組(16 mg·kg-1)、Rhy-SDP高劑量組(80 mg·kg-1)和Rhy-SDP低劑量組(16 mg·kg-1),每組20只,雌雄各半[9-11]。各組按照每日10 mg·kg-1灌胃給藥1次,連續(xù)給藥12周,每日觀察大鼠的一般狀況、隔1周記錄1次大鼠體質(zhì)量的變化。末次給藥后24 h,各組隨機挑選大鼠10只進行血液學(xué)相關(guān)指標的檢測。取血后,處死大鼠,取其心、腦、腎、肝等器官,計算臟體比值(mg·g-1),并用體積分數(shù)為10%的甲醛溶液固定大鼠器官,常規(guī)石蠟包埋,制作切片,HE染色,光鏡下觀察器官的組織病理學(xué)變化。剩余10只動物停藥,繼續(xù)飼養(yǎng)觀察2周后,同上述方法進行檢測[12-14 ]。

3 結(jié)果

3.1Rhy-SDP的形態(tài)觀察與粒徑分布 滴加經(jīng)稀釋的Rhy-SLN混懸液1 滴于覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上,以質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的磷鎢酸負染,室溫干燥,透射電子顯微鏡下觀察藥物納米結(jié)晶形貌。Rhy-SLN呈圓形,分布均勻。見圖1。

室溫條件下,將所制得的Rhy-SLN混懸液,以純化水稀釋 20 倍,NanoZS90 激光粒度儀上測定納米粒的粒徑、粒徑分布,結(jié)果顯示平均粒徑在180 nm左右。見圖2。

圖1Rhy-SLN透射電鏡圖

Fig.1 The scanning electron microscopy of Rhy-SLN

圖2Rhy-SLN粒徑分布

Fig.2 The distribution of size of Rhy-SLN

3.2急性毒性實驗 給藥后,空白對照組小鼠未見異常反應(yīng),Rhy-SLN劑量組和Rhy-SDP劑量組的小鼠毒性反應(yīng)基本相似,Rhy-SLN劑量組小鼠毒性反應(yīng)輕于Rhy-SDP劑量組。部分小鼠出現(xiàn)活動減少、呼吸急促、攝食量減少,部分小鼠出現(xiàn)死亡情況,死亡小鼠尸檢主要臟器心、腦、腎、肝未見明顯異常,存活動物24 h后恢復(fù)正常。用BLISS統(tǒng)計法計算得Rhy-SLN的LD50為2 125.5 mg·kg-1,95%CI為2 019.2～2 231.6 mg·kg-1；Rhy-SDP的LD50為1 900.7 mg·kg-1,95%CI為1 651.8～2 167.9 mg·kg-1。

3.3長期毒性實驗

3.3.1大鼠一般狀況觀察 給藥期間,空白對照組、Rhy-SLN高劑量組、Rhy-SLN低劑量組和Rhy-SDP低劑量組大鼠的一般狀態(tài)、行為活動及糞便等未見明顯的異常變化,停藥恢復(fù)2周后,亦無明顯變化。Rhy-SDP高劑量組大鼠出現(xiàn)毛色暗淡無光、行為緩慢、體質(zhì)量增長緩慢；停藥恢復(fù)2周后大鼠狀態(tài)基本恢復(fù)正常,體質(zhì)量增長恢復(fù)正常。Rhy-SLN和Rhy-SDP不同劑量組對大鼠的體質(zhì)量影響不同,但與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

3.3.2對大鼠血液學(xué)指標的影響 末次給藥后及恢復(fù)期的空白對照組、Rhy-SLN及Rhy-SDP各給藥組大鼠的WBC、RBC、HB、PLT、LYM和NEU的數(shù)值均在正常范圍內(nèi),無明顯的變化。見表1～2。

表1Rhy-SLN和Rhy-SDP對大鼠血液學(xué)指標的影響

Tab.1 The effects of Rhy-SLN and Rhy-SDP on hematology index in rats (n=10,±s)

表2恢復(fù)期Rhy-SLN和Rhy-SDP對大鼠血液學(xué)指標的影響

Tab.2 The effects of Rhy-SLN and Rhy-SDP on hematology indexes in rats of recovery phase (n=10,±s)

圖3大鼠體質(zhì)量變化曲線

Fig.3 Curve of the rat body quality variation

3.3.3對大鼠血液生化學(xué)指標的影響 各給藥組大鼠給予Rhy-SLN和Rhy-SDP 12周后,大鼠血清中ALT、AST和ALP的數(shù)值升高,且有一定的劑量依賴性。Rhy-SDP高劑量組大鼠血清ALT、AST和ALP活性與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),Rhy-SLN高劑量組大鼠血清ALT活性與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

大鼠停止用藥恢復(fù)2周后,各給藥組大鼠的血液生化指標均已明顯恢復(fù),Rhy-SDP高劑量組ALT活性與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

3.3.4臟體比值 各給藥組大鼠給予Rhy-SLN和Rhy-SDP 12周后,其中Rhy-SLN低、高劑量組和Rhy-SDP低劑量組大鼠的心、腦、腎的臟體比與空白對照組比較均無明顯變化；Rhy-SDP高劑量組大鼠肝的臟體比與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表3Rhy-SLN和Rhy-SDP對大鼠血液生化學(xué)指標的影響

Tab.3 The influence of Rhy-SLN and Rhy-SDP on blood biochemical indexes in rats (n=10,±s)

注：與空白對照組比較*P<0.05。

表4恢復(fù)期Rhy-SLN和Rhy-SDP對大鼠血液生化學(xué)指標的影響

Tab.4 The influence of Rhy-SLN and Rhy-SDP on blood biochemical index in rats recovery phase (n=10,±s)

注：與空白對照組比較*P<0.05。

見表6。由表6可知,大鼠停止用藥恢復(fù)2周后,Rhy-SLN和Rhy-SDP的低、高劑量組大鼠的心、腦、腎、肝的臟體比與空白對照組比較均無顯著變化。

表5Rhy-SLN和Rhy-SDP對大鼠臟體比值的影響

Tab.5 The influence of Rhy-SLN and Rhy-SDP on the ratio of organs to body in rats (n=10,±s,mg·g-1)

注：與空白對照組比較*P<0.05。

表6恢復(fù)期Rhy-SLN和Rhy-SDP對大鼠臟體比值的影響

Tab.6 The influence of Rhy-SLN and Rhy-SDP on the ratio of organs to body in rats of recovery phase (n=10,±s,mg·g-1)

3.3.5病理組織學(xué)觀察

3.3.5.1心、腦、腎 各組大鼠心臟、腦組織和腎臟結(jié)構(gòu)均正常,未見明顯異常。

3.3.5.2肝 空白對照組肝臟組織結(jié)構(gòu)完整,未見肝細胞腫脹壞死,肝小葉輪廓清晰,間質(zhì)未見明顯炎癥細胞浸潤,見圖4A。Rhy-SLN低、高劑量組和Rhy-SDP低劑量組大鼠肝組織未見明顯異常,見圖4B。Rhy-SDP高劑量組大鼠肝組織部分失去正常結(jié)構(gòu),大部分肝細胞腫脹,胞質(zhì)空網(wǎng)狀,似氣球樣變,部分肝細胞出現(xiàn)壞死,見圖4C。停藥恢復(fù)期大鼠Rhy-SLN低、高劑量組和Rhy-SDP低劑量組肝組織均未出現(xiàn)異常,Rhy-SDP高劑量組大鼠肝細胞腫脹減輕,氣球樣變消失,仍有個別點狀壞死灶,見圖4D。

圖4大鼠肝臟病理切片圖

A.空白對照組；B.Rhy-SLN低、高劑量組和Rhy-SDP低劑量組；C.Rhy-SDP高劑量組；D.Rhy-SDP高劑量組恢復(fù)期。

Fig.4 The pathological image of rat liver

A.Blank control group；B.low and high-dose groups of Rhy-SLN and low-dose group of Rhy-SDP；C.high-dose groups of Rhy-SDP；D.high-dose groups of Rhy-SDP recovery phase.

4 討論

鉤藤總生物堿為鉤藤的主要有效活性成分,其中主要的是鉤藤堿和異鉤藤堿,分別占鉤藤總生物堿的28.9%和14.7%[15-17]。研究發(fā)現(xiàn),鉤藤堿具有抗血栓形成、抗血小板聚集等作用[18-20]。筆者在前期將鉤藤堿制成緩釋滴丸并進行了相關(guān)藥理和毒性研究,為了進一步改善鉤藤堿的劑型、增加生物利用度、減少毒性反應(yīng),筆者利用現(xiàn)代納米技術(shù)將鉤藤堿制成固體脂質(zhì)納米粒,并進行了急性毒性和長期毒性的實驗研究。

實驗發(fā)現(xiàn),Rhy-SLN的LD50值(2 125.5 mg·kg-1)高于Rhy-SDP(1 900.7 mg·kg-1)的LD50值,說明Rhy-SLN對小鼠的急性毒性低于Rhy-SDP。死亡動物的重要器官未見明顯異常。

在長期實驗中,給予大鼠灌胃給藥12周后,Rhy-SDP高劑量組大鼠出現(xiàn)毛色暗淡無光、行為緩慢、體質(zhì)量增長緩慢等現(xiàn)象；血液學(xué)指標基本正常,血液生化指標中AST、ALT和ALP的活性均有不同程度的升高；大鼠心、腦、腎臟的臟體比值無明顯變化,肝臟的臟體比值明顯升高；病理學(xué)結(jié)果顯示,肝組織部分失去正常結(jié)構(gòu),大部分肝細胞腫脹,胞質(zhì)空網(wǎng)狀,似氣球樣變,部分肝細胞出現(xiàn)壞死?；謴?fù)2周后Rhy-SLN低、高劑量組和Rhy-SDP低劑量組肝組織均未出現(xiàn)異常,Rhy-SDP高劑量組大鼠肝細胞腫脹減輕,氣球樣變消失,仍有個別點狀壞死灶。

研究結(jié)果顯示,Rhy毒性靶器官為肝臟,Rhy-SLN長期大劑量大鼠灌胃給藥,可產(chǎn)生一定的肝臟毒性；Rhy-SLN長期大劑量大鼠灌胃給藥,肝臟毒性不明顯。結(jié)果表明,固體脂質(zhì)納米粒劑型可顯著降低Rhy對肝臟的損害,降低大鼠血液AST和ALT水平,其具體機制有待進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典：2010年版：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：92.

[2] 王盟,華南,王超花,等.鉤藤總堿緩釋滴丸的急性毒性研究[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,6(30)：405-406.

[3] 田曉紅,宋朝功.天麻鉤藤飲加減治療妊娠高血壓綜合征36例[J].中國民政醫(yī)學(xué)雜志,2001,13(4):203.

[4] 葉齊,齊荔紅.鉤藤的主要成分及生物活性研究進展[J].西北藥學(xué)雜志,2012,27(5)：508-510.

[5] 劉衛(wèi),王盟,楊雪萍，等.鉤藤總堿緩釋滴丸的制備、含量測定和釋放度考察[J].中國藥房,2011,12(31)：2905-2907.

[6] 王丹,曹思碩,康樺,等.銀杏蓯蓉配方急性毒性和亞慢性毒性實驗研究[J].西北藥學(xué)雜志,2016,31(6):599-604.

[7] 王金,王芳.藤珠胃康顆粒急性毒性和長期毒性實驗[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2016,36(4)：68-71.

[8] 孫蓉,楊倩,趙燕.山豆根不同組分小鼠急性毒性比較研究[J].中國藥物警戒,2010,7(5):257-261.

[9] 徐叔云,卞如滾,陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:226-240.

[10]國家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S].2005：20-21.

[11]李艷青,李瑞霞,段燕康,等.坤泰膠囊浸膏對大鼠的長期毒性研究[J].中草藥，2015,46(7)：1023-1027.

[12]陸泉,蔣麗平,張飛,等.寧泌泰膠囊對大鼠的長期毒性研究[J].中國藥業(yè),2016,25(15)：46-48.

[13]王盟,孫清海,劉衛(wèi),等.鉤藤總堿緩釋滴丸的長期毒性實驗研究[J].國際中醫(yī)中藥雜志,2014,36(10)：905-908.

[14]張光際,楊凡,時樂,等.克方的急性毒性和長期毒性實驗研究[J].中國藥房,2016,27(34)：4777-4779.

[15]何昱,洪筱坤,王智華.鉤藤及其有效成分的藥理研究進展[J].上海中醫(yī)藥雜志,2003,37(11)：58.

[16]吳偉明,李志峰,歐陽輝,等.鉤藤化學(xué)成分分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2015,21(18):56-58.

[17]李雅臣,馬雪梅,陳鴻英,等.鉤藤總生物堿提取溶劑的選擇探討,2003,20(1)：67-68.

[18]王群,李江疆.鉤藤堿對心血管系統(tǒng)部分藥理作用研究[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志,1998,20(5)：289-292.

[19]陳長勛,金若敏.鉤藤堿抗血小板聚集和抗血栓形成的作用研究[J].醫(yī)學(xué)研究通訊,1999,28(1)：8-11.

[20]孫明軍,李海軍.天麻鉤藤飲加減治療神經(jīng)衰弱500例[J].河南中醫(yī)藥學(xué)刊,1998,13(4):520-522.