近紅外光譜技術(shù)快速測(cè)定杞菊地黃丸中馬錢苷的含量

劉建營(yíng),白 雁,雷敬衛(wèi)

(1.駐馬店市中心醫(yī)院藥學(xué)部，駐馬店 463000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046)

杞菊地黃丸(濃縮丸)主要由枸杞、菊花、熟地黃、山茱萸(制)、牡丹皮、山藥、茯苓和澤瀉組成，具有滋腎養(yǎng)肝、增強(qiáng)免疫力、抗衰老、改善肝臟脂肪代謝和促進(jìn)肝細(xì)胞新生的功效，主治肝腎陰虧、眩暈耳鳴、羞明畏光和迎風(fēng)流淚等癥[1-3]。馬錢苷為杞菊地黃丸中的主要有效成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗休克等作用[4-5]?，F(xiàn)在多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)杞菊地黃丸中馬錢苷的含量測(cè)定采用HPLC法，該方法需對(duì)樣品做較為復(fù)雜的前處理，且消耗大量有機(jī)試劑。近紅外光譜技術(shù)(NIR)作為一種應(yīng)用性分析方法，近年來(lái)發(fā)展迅速,該技術(shù)具有分析速度快、操作簡(jiǎn)便和低消耗等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[6-9]。本實(shí)驗(yàn)利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)杞菊地黃丸中馬錢苷的快速分析。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Thermo Nicolet 6700型近紅外光譜儀(配有OMNIC光譜采集軟件和TQ 8.0分析軟件)(美國(guó)賽默飛世爾公司)；Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，Reo-Pure 75LPIM超純水器(美國(guó)沃特世公司)；METTLER AE-200型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；SK3300LH型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；高速藥材粉碎機(jī)(鄭州裕強(qiáng)機(jī)械設(shè)備有限公司)。

1.2試藥 河南宛西制藥有限公司提供的113份不同批次的杞菊地黃丸樣品，粉碎，過(guò)80目篩，備用；色譜純:甲醇(天津四友試劑有限公司)，乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心)；磷酸(分析純，天津凱通試劑有限公司)；馬錢苷對(duì)照品(供測(cè)定含量用，批號(hào)121072-201109)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1采集近紅外光譜數(shù)據(jù) 113份杞菊地黃丸樣品，各取8 g，置于石英杯中。實(shí)驗(yàn)室溫度為21～29 ℃，相對(duì)濕度為45%～62%。近紅外光譜儀參數(shù)設(shè)置為：測(cè)樣方法為積分球漫反射，掃描波段為12 000～4 000 cm-1，分辨率為8 cm-1，掃描次數(shù)為64次。每份樣品重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算出平均光譜，用于建立模型。杞菊地黃丸樣品的近紅外光譜疊加圖見(jiàn)圖1。

圖1杞菊地黃丸的近紅外光譜圖

Fig.1 NIR spectra of Qijudihuang Pills

2.2馬錢苷的含量測(cè)定

2.2.1馬錢苷對(duì)照品溶液的制備 取馬錢苷對(duì)照品適量，精密稱定，加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶液制成質(zhì)量濃度為60 μg·mL-1溶液，備用。

2.2.2杞菊地黃丸供試品溶液的制備 取杞菊地黃丸粉末1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，加在中性氧化鋁柱(100～200 目，4 g，內(nèi)徑為1 cm)上，用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇50 mL洗脫，收集流出液與洗脫液，蒸干，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶解，移至5 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.2.3色譜條件 色譜柱型號(hào)為Sunfire C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶1 mL·L-1磷酸溶液(4∶11∶85);等度洗脫；流速為1.5 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。按照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，所得杞菊地黃丸HPLC圖見(jiàn)圖2。

圖2HPLC圖

A．對(duì)照品；B.樣品；1.馬錢苷。

Fig.2 HPLC chromatograms

A．control；B.sample；1.loganin.

2.2.4樣品中馬錢苷的含量測(cè)定 按照2.2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定113份杞菊地黃丸中馬錢苷的含量，每份樣品平行測(cè)定3次，求得平均值。113份樣品馬錢苷的含量范圍為1.18～1.85 mg·g-1。

3 模型的建立與驗(yàn)證

3.1杞菊地黃丸中馬錢苷定量分析模型的建立

3.1.1校正集與驗(yàn)證集的選擇 以驗(yàn)證集的馬錢苷含量分布范圍在校正集的馬錢苷含量范圍之內(nèi)為原則，使用TQ 8.0定量分析軟件中偏最小二乘法建立模型。根據(jù)杞菊地黃丸中馬錢苷的含量分布情況，從113份樣品中選取86個(gè)有代表性的樣品(馬錢苷含量范圍為1.17～1.85 mg·g-1)組成校正集，27個(gè)樣品(馬錢苷含量范圍為1.21～1.82 mg·g-1)為驗(yàn)證集，對(duì)模型進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證。

3.1.2光譜范圍及預(yù)處理方法的選擇 近紅外光譜為O-H、N-H、C-H等基團(tuán)伸縮振動(dòng)的倍頻和組頻吸收，其圖譜中各峰重疊嚴(yán)重，用常規(guī)的線性分析方法無(wú)法分析[10-13]。因此，使用化學(xué)計(jì)量學(xué)中PLS法建立模型，以校正均方差、交叉檢驗(yàn)決定系數(shù)、交互驗(yàn)證均方差、預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)和預(yù)測(cè)均方差等參數(shù)來(lái)確定最優(yōu)模型[14-16]。對(duì)于同一樣品集所構(gòu)建的近紅外定量校正模型，相關(guān)系數(shù)越大、均方差越小，所建模型適用性越強(qiáng)、預(yù)測(cè)效果越好[17-19]。經(jīng)篩選比較，最終確定一階導(dǎo)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量為光譜進(jìn)行預(yù)處理方法，7 465.17～4 111.36 cm-1為最佳波段范圍，見(jiàn)表1和圖3。

表1不同預(yù)處理方法優(yōu)化的校正模型結(jié)果

Tab.1 The optimized results with different preprocessing methods

光譜預(yù)處理方法交叉檢驗(yàn)決定系數(shù)校正均方差一階導(dǎo)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量0.99860.0426二階導(dǎo)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量0.92170.0766一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正0.67990.1470二階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正0.97860.0851一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正+Norris平滑0.57340.4130二階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正+Norris平滑0.84140.1150一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正+Savitzky-Golay平滑0.69370.2380二階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正+Savitzky-Golay平滑0.85440.7640一階導(dǎo)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量+Savitzky-Golay平滑0.76980.1190二階導(dǎo)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量+Savitzky-Golay平滑0.89680.4530一階導(dǎo)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量+Norris平滑0.76480.1570二階導(dǎo)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量+Norris平滑0.74480.2360

圖3杞菊地黃丸NIR一階導(dǎo)數(shù)圖譜

Fig.3 NIR first derivative of Qijudihuang Pills

3.1.3主因子數(shù)的選擇 建模過(guò)程中，主因子數(shù)決定著模型的復(fù)雜程度和預(yù)測(cè)能力[19]。本實(shí)驗(yàn)中，以7為主因子數(shù)建模時(shí)，馬錢苷校正模型的交互驗(yàn)證均方差為0.093 4，為最小，見(jiàn)圖4。

3.1.4杞菊地黃丸中馬錢苷定量分析模型的建立 當(dāng)以113份樣品中86份組成校正集，27份驗(yàn)證集，一階導(dǎo)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量為光譜進(jìn)行預(yù)處理方法，7 465.17～4 111.36 cm-1為最佳波段范圍，7為主因子數(shù)建模時(shí)，馬錢苷校正模型的交叉檢驗(yàn)決定系數(shù)r=0.998 8，校正均方差RMSEC為0.041 6，各項(xiàng)參數(shù)評(píng)價(jià)良好。此時(shí)NIR預(yù)測(cè)值與參考值的相關(guān)圖見(jiàn)圖5。

圖4主因子數(shù)對(duì)模型交互驗(yàn)證均方差的影響

Fig.4 The influence of root mean square error of cross-validation value with different factors

圖5NIR預(yù)測(cè)值與參考值的相關(guān)性

Fig.5 Correlation between NIR predicted and actual values

3.2NIR定量模型的外部驗(yàn)證 采集15份杞菊地黃丸驗(yàn)證集樣品的近紅外圖譜，將其導(dǎo)入馬錢苷定量分析模型中，得到馬錢苷含量的預(yù)測(cè)值。將馬錢苷模型預(yù)測(cè)值與HPLC法測(cè)得值進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示，馬錢苷的預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)r=0.986 7，預(yù)測(cè)均方差RMSEP為0.084 9，結(jié)果表明，模型可準(zhǔn)確測(cè)定杞菊地黃丸中馬錢苷的含量。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用近紅外光譜技術(shù)為杞菊地黃丸(濃縮丸)建立了馬錢苷含量的近紅外定量分析模型。近紅外光譜技術(shù)是一種間接分析技術(shù)，其定量分析模型的準(zhǔn)確性是建立在大量具有代表性樣品的精準(zhǔn)測(cè)定及模型后期持續(xù)不斷的完善之上。在建立過(guò)程中，所選樣品代表性越強(qiáng)，模型的實(shí)用性就越強(qiáng)，這需花費(fèi)大量的時(shí)間和精力。模型建成后，只需掃描獲得杞菊地黃丸樣品的近紅外圖譜，輸入模型即可直接測(cè)得杞菊地黃丸中馬錢苷的含量，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供快速、無(wú)污染的方法。本實(shí)驗(yàn)使用的樣品由單一廠家提供，所建模型僅限于該廠家杞菊地黃丸的使用，不可應(yīng)用于其他廠家。在以后的實(shí)驗(yàn)中，可根據(jù)實(shí)際需求，完善不同廠家、不同批次杞菊地黃丸近紅外模型的建立，更好地服務(wù)于生產(chǎn)。

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