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    嗜水氣單胞菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

    2018-01-12 11:39:28王帥兵熊良偉朱善元徐建生吳海波
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年24期
    關(guān)鍵詞:水氣毒力致病性

    王帥兵, 熊良偉, 朱善元,2, 徐建生, 吳海波, 王 婧, 張 龍

    (1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300; 2.江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇泰州 225300;3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009)

    嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是廣泛存在于水體中的一種正常共棲菌,有致病菌和非致病菌之分。致病性嗜水氣單胞菌是水生動物細(xì)菌性疾病的主要病原之一,可引起魚、蛙、鱉等水生動物出血性敗血癥[1]。近年來,該病在我國各地廣泛流行,大規(guī)模暴發(fā),死亡率高,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。使用抗菌藥是目前防治水生動物細(xì)菌性疾病的主要手段。然而,大量研究證明,嗜水氣單胞菌已對多種藥物產(chǎn)生耐藥性[2-3],給水生動物疾病防治帶來困難。

    本試驗(yàn)從江蘇、上海等不同地區(qū)疑似嗜水氣單胞菌病的水生動物采集病料,進(jìn)行細(xì)菌分離,以嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株為參照,經(jīng)鑒定獲得4個不同來源的嗜水氣單胞菌,進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并作比較分析,為有效防治嗜水氣單胞菌病、監(jiān)控嗜水氣單胞菌的耐藥性提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    細(xì)菌生化反應(yīng)微量、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、AHM鑒別培養(yǎng)基、5%兔血平板、1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨、藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司。

    1.2 試驗(yàn)用動物

    異育銀鯽,約100 g/尾,購自江蘇省泰州市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場,購回后在實(shí)驗(yàn)室訓(xùn)養(yǎng)、觀察1周無異常情況,備用。

    1.3 病原菌的分離與純培養(yǎng)

    無菌操作取疑似出血病的魚病灶組織(血液、肺、肝胰腺、腎臟等),分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)24 h,分別挑取可疑菌落,涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

    挑取革蘭氏鏡檢為陰性短桿菌的疑似菌落在普通瓊脂培養(yǎng)基上多次劃線純化,直至得到形態(tài)一致、特征穩(wěn)定的菌落。選取單個菌落轉(zhuǎn)接到瓊脂斜面28 ℃培養(yǎng)18 h,置4 ℃冰箱保存、編號備用。

    1.4 革蘭氏染色及生理生化特性試驗(yàn)

    分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)株分別連續(xù)單傳3代純培養(yǎng)后挑取單個菌落,進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,穿刺接種AHM培養(yǎng)基及接種微量生化管,按常規(guī)方法進(jìn)行AHM鑒別培養(yǎng)、氧化酶試驗(yàn)及吲哚、甲基紅、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷等生化鑒定。

    1.5 菌株的致病性鑒別

    1.5.1 溶血試驗(yàn)和溶蛋白試驗(yàn) 取純培后的單個菌落分別劃線接種于5%無菌兔血平板和1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板,置28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察溶血情況和溶蛋白情況。兔血平板上若在菌落周圍形成不透明的草綠色溶血環(huán),認(rèn)定為α溶血;若在菌落周圍形成清晰、完全透明的溶血環(huán),則認(rèn)定為β溶血;若菌落周圍無溶血現(xiàn)象,則認(rèn)定為γ溶血。1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板若菌落周圍出現(xiàn)清晰、透明的溶蛋白圈,則認(rèn)定為陽性,否則為陰性。

    1.5.2 毒力因子提取與檢測 (1)Aer毒素的提取與檢測。各菌株接種到肉湯培養(yǎng)基后28 ℃培養(yǎng)48~60 h,4 500 r/min離心,取上清。參照文獻(xiàn)[4]的方法,先用20%飽和度硫酸銨在 4 ℃ 沉淀4 h,5 000 r/min離心后取上清,再用60%飽和度硫酸銨沉淀,4 ℃過夜,5 000 r/min離心,沉淀用50 mmol/L Tris-HCl(pH值為7.8~8.0)溶解后透析2 d,12 000 r/min離心 5 min,上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

    (2)胞外蛋白酶(ECPase)的提取與檢測。各菌株分別用肉湯培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)48~60 h,4 500 r/min離心,取上清,參照文獻(xiàn)[5]的方法,用70%飽和度硫酸銨沉淀,4 ℃過夜,5 000 r/min 離心,沉淀用50 mmol/L Tris-HCl(pH值7.8~8.0)溶解并透析2 d,12 000 r/min離心5 min,上清進(jìn)行 SDS-PAGE電泳。

    1.5.3 回歸感染試驗(yàn) 嗜水氣單胞菌接種于瓊脂平板,于28 ℃培養(yǎng)18~20 h,挑取單個菌落接種于瓊脂平板擴(kuò)大培養(yǎng)18~24 h。無菌條件下向培養(yǎng)皿中加入少量無菌生理鹽水,用玻璃刮仔細(xì)刮下菌苔。離心,取沉淀用生理鹽水洗滌2次。用1 mL生理鹽水懸浮,分光光度法測菌液濃度后,用無菌肉湯培養(yǎng)基分別調(diào)整菌濃度至1×108CFU/mL。將2種濃度的菌液肌肉注射進(jìn)行攻菌,劑量為1 mL/尾[6],同時用無菌肉湯培養(yǎng)基作陰性對照。10尾魚/組,每天換水1/3,每3~4 h觀察并記錄死亡情況,對死亡魚進(jìn)行解剖和病原再分離,以確定是否由攻毒活菌引起死亡。

    1.6 藥敏試驗(yàn)

    按K-B藥敏紙片擴(kuò)散法[7]進(jìn)行操作,取單個菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)16 h,調(diào)整菌濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠁挝?。用無菌棉拭子蘸取調(diào)整好的菌液于管壁擠去多余液體,均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板,待培養(yǎng)基表面干燥后放置藥敏紙片使其緊貼培養(yǎng)基表面,各紙片的中心距離不小于24 mm,紙片距培養(yǎng)皿邊緣的距離不小于15 mm。于28 ℃培養(yǎng)24 h后,用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑,根據(jù)杭州微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)判斷分離菌株對藥物敏感性。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)菌形態(tài)觀察及AHM鑒別反應(yīng)

    標(biāo)準(zhǔn)株及4株分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)24 h后生長良好,標(biāo)準(zhǔn)株及4個菌株菌落特征均為圓形、表面光滑、中央凸起、邊緣整齊、白色、不透明、大小約2 mm。在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基明顯變渾濁,試管底部有乳白色沉淀,輕搖后乳白色沉淀均勻懸浮。取瓊脂培養(yǎng)基上的單個菌落分別進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢均可見紅色、兩端鈍圓的短桿菌,判定為革蘭氏陰性桿菌。4株分離菌在AHM鑒定培養(yǎng)基上沿穿刺線呈刷狀生長(運(yùn)動力為陽性),培養(yǎng)基頂部顯紫色,底部為淡黃色,與嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株特性一致。標(biāo)準(zhǔn)株及4株分離菌編號及來源見表1。

    表1 5株分離菌的編號及來源

    2.2 分離菌株生理生化特性

    篩選出的4株分離菌吲哚、氧化酶試驗(yàn)均呈陽性。葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷等糖發(fā)酵試驗(yàn)均呈陽性,不能利用乳糖和鳥氨酸,與標(biāo)準(zhǔn)株反應(yīng)一致,符合致病性嗜水氣單胞菌特性[8]。生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果見表2。

    2.3 分離菌株致病性及毒力因子檢測結(jié)果

    4個分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)株溶血試驗(yàn)均表現(xiàn)為β溶血,溶蛋白試驗(yàn)均可見明顯的溶蛋白圈,表明分離菌及標(biāo)準(zhǔn)株均具致病性(表3)。

    表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

    注:“+”表示陽性反應(yīng),“-”表示陰性反應(yīng)。

    表3 5株分離菌的毒性試驗(yàn)結(jié)果

    提取毒力因子Aer毒素和ECPase,進(jìn)行SDS-PAGE電泳后均可找到相應(yīng)條帶,各菌株的Aer毒素約為45 ku,雜帶少;各菌株的ECPase約為35 ku,雜帶相對較多。SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖1、圖2。

    2.4 回歸試驗(yàn)結(jié)果

    試驗(yàn)組鯽魚在接種感染后12 h表現(xiàn)出游動變緩、攝食減少或拒食現(xiàn)象,此后相繼出現(xiàn)體平衡能力減弱、廢食等現(xiàn)象,在接種后3~5 d開始出現(xiàn)明顯死亡,到7 d時死亡率均達(dá)60%以上,陰性對照組在試驗(yàn)期內(nèi)正常存活,未出現(xiàn)死亡(表4)。對感染死亡的魚進(jìn)行分離培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定,結(jié)果與嗜水氣單胞菌特征一致。

    2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

    4個菌株及標(biāo)準(zhǔn)株對14種抗菌藥物敏感性結(jié)果見表5。由表5可知,包括標(biāo)準(zhǔn)菌株在內(nèi)的5個菌株對阿米卡星、左氧氟沙星和氟苯尼考均表現(xiàn)出高度敏感性;對氨芐西林、阿莫西林、紅霉素和四環(huán)素基本不敏感;5個菌株對阿奇霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、 復(fù)方新諾明的敏感性表現(xiàn)不盡相同,對鏈霉素、慶大霉素總體表現(xiàn)敏感,對阿奇霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明均表現(xiàn)出一定的耐藥性。

    表4 分離菌株對健康鯽魚的感染試驗(yàn)結(jié)果

    表5 嗜水氣單胞菌對14種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

    3 分析與討論

    嗜水氣單胞菌有致病菌和非致病菌之分,致病菌可引起多種水生動物流行性傳染病的暴發(fā),其致病性與毒力因子有關(guān),目前已知的毒力因子主要有以Aer毒素為主的外毒素、胞外蛋白酶、結(jié)構(gòu)蛋白和信號相關(guān)蛋白。Aer毒素是嗜水氣單胞菌引起變溫動物溶血和出血的主要毒力因子,常在胞外蛋白酶的協(xié)同下發(fā)揮致病作用[9]。因此,Aer毒素和ECPase成為鑒別致病性嗜水氣單胞菌的重要依據(jù)。本試驗(yàn)通過提取5個菌株Aer毒素和ECPase并進(jìn)行SDS-PAGE電泳,均可得到相應(yīng)蛋白條帶。其中,45 ku是弱致病株Aer毒素的特征條帶,35 ku蛋白是胞外蛋白酶被2-巰基乙醇裂解后的產(chǎn)物[10],為具有典型腸毒素性狀的細(xì)菌外毒素。這進(jìn)一步證實(shí)4個分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)株均為致病性嗜水氣單胞菌。

    嗜水氣單胞菌引發(fā)的魚類出血病給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前,使用抗菌藥物是防治魚類出血病的常用手段。藥敏試驗(yàn)表明,嗜水氣單胞菌對阿米卡星、左氧氟沙星和氟苯尼考普遍敏感,在防治水生動物嗜水氣單胞菌感染疾病時可優(yōu)先選用;對鏈霉素和慶大霉素總體表現(xiàn)敏感,可作為備選藥物。對阿奇霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、復(fù)方新諾明部分菌株表現(xiàn)中度敏感,部分存在耐藥性,生產(chǎn)中應(yīng)合理控制、科學(xué)使用。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同來源的嗜水氣單胞菌對氨芐西林、阿莫西林、紅霉素和四環(huán)素均產(chǎn)生耐藥性,與以往報(bào)道[11-12]基本一致,生產(chǎn)中應(yīng)避免使用上述藥物。4個分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)株對阿奇霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、復(fù)方新諾明的敏感性結(jié)果存在差異,可能因養(yǎng)殖水域、養(yǎng)殖品種、用藥方法和用藥種類不同,導(dǎo)致嗜水氣單胞菌產(chǎn)生耐藥性的藥物種類也不同。防治嗜水氣單胞等引起的細(xì)菌性疾病時,應(yīng)選用高度敏感的藥物,有效控制疾病,減少經(jīng)濟(jì)損失。同時,嚴(yán)格按規(guī)定劑量用藥,注意交替用藥或輪換用藥,避免連續(xù)使用同一藥物或同類藥物,從而避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。此外,使用特異性卵黃抗體、中草藥對嗜水氣單胞菌感染也有一定防治效果[13-14]。

    嗜水氣單胞菌是一種條件致病菌,一旦感染引發(fā)疾病則較難控制,因此重在預(yù)防。養(yǎng)殖前期應(yīng)做好魚塘和魚種的消毒工作,養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意控制養(yǎng)殖密度,保持良好的水質(zhì),保證科學(xué)合理的餌料營養(yǎng)供給,發(fā)現(xiàn)病魚及時隔離和診斷。此外,使用高效的新型疫苗也是預(yù)防嗜水氣單胞菌感染的重要手段。然而,因水生動物給藥的特殊性及病原菌血清型的多樣化[15],目前使用的菌苗不能獲得理想效果。因此,以細(xì)菌毒力因子為基礎(chǔ)開發(fā)可口服的亞單位疫苗是未來防治嗜水氣單胞菌感染的重要方向。

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