土田七莖尖離體快繁技術(shù)研究

潘 梅， 黃 賽， 楊 珺， 戚華沙， 符瑞侃， 王景飛， 呂德任

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶園藝研究所，?？?571100)

土田七[Stahlianthusinvolucratus(King ex Baker) Craib ex Loesener]是姜目姜科土田七屬多年生直立草本植物，植株高20～30 cm，葉基生，披針形，葉面深綠色，葉背綠色或淡紫紅色；花序從根莖抽出，10～15朵花聚生于鐘狀的總苞內(nèi)，花白色，唇瓣中央具杏黃色斑?；ㄆ?—7月，分布于我國(guó)海南、廣東、廣西和福建，生于海拔800～900 m的林下、荒坡蔭濕處[1]。土田七株形好，葉美麗可賞，花奇特，根莖具芳香味，是極好的林下地被和盆栽觀葉觀花植物。目前土田七仍處于野生狀態(tài)，用根莖進(jìn)行繁殖，繁殖速度慢。組織培養(yǎng)技術(shù)是快速繁育種苗和保護(hù)資源最為有效的方法。目前未見(jiàn)有土田七組織培養(yǎng)與快速繁殖的報(bào)道，土田七屬其他植物的組培快繁也未見(jiàn)有報(bào)道。無(wú)機(jī)鹽和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物的離體繁殖有著重要的影響，直接影響到培養(yǎng)物的培養(yǎng)效果。本研究通過(guò)比較無(wú)機(jī)鹽和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)土田七芽增殖及生根的影響，以建立土田七的快速繁殖技術(shù)，為其規(guī)模化生產(chǎn)提供種苗。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為土田七莖尖，取自海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶園藝研究所苗圃。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒與誘導(dǎo) 于晴天取土田七莖段，在流水下沖洗干凈，剝?nèi)ト~片切取帶莖尖長(zhǎng)約3 cm的小段，用洗潔精液浸泡10 min，清洗后移入超凈工作臺(tái)上，先用75%乙醇振蕩30 s，再用0.1% HgCl2浸泡15 min，最后用無(wú)菌水沖洗5次。以MS+0.5 mg/L NAA作為基本培養(yǎng)基，設(shè)置6-BA 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L共5個(gè)處理，切除底部保留帶莖尖長(zhǎng)約1.5 cm的小段，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每種處理接種25瓶，每瓶接入1個(gè)外植物體，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)芽數(shù)。

1.2.2 不同MS無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)芽增殖的影響 設(shè)置5種MS無(wú)機(jī)鹽濃度，即1/4、1/2、3/4、1、3/2倍MS，分別添加6-BA 2.0 mg/L，共5種處理。每種處理接種10瓶，每瓶3個(gè)單芽，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)。

1.2.3 不同6-BA與NAA組合對(duì)芽增殖的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)6-BA(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L)與NAA(0、0.2、0.5 mg/L)不同配比，共15種處理。每種處理接種10瓶，每瓶3個(gè)單芽，3次重復(fù)，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.4 不同MS無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)小苗生根的影響 設(shè)置4種MS無(wú)機(jī)鹽濃度，即1/4、1/2、3/4、1倍MS，分別添加NAA 0.5 mg/L，共4個(gè)處理。將高度約3 cm的小苗接入各處理培養(yǎng)基上，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、株高、平均根數(shù)和最長(zhǎng)根。

1.2.5 不同生長(zhǎng)素及濃度對(duì)小苗生根的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置NAA(0.2、0.4、0.6 mg/L)與IBA(0、0.1、0.2 mg/L)的不同配比，以不添加生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基作為對(duì)照，共7種處理。將高度達(dá)到3 cm的小苗接入各種生根培養(yǎng)基上，比較根系分化情況。每種處理接種10瓶，每瓶3株，3次重復(fù)，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、株高和平均根數(shù)。

1.2.6 生根苗的煉苗與移栽 將培養(yǎng)30 d根系發(fā)達(dá)的土田七組培苗移入蔭棚，煉苗5 d后，取出小苗洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移入基質(zhì)中，澆水淋透，適當(dāng)遮蔭保濕，30 d后統(tǒng)計(jì)植株的成活率。

1.3 培養(yǎng)條件

材料接入培養(yǎng)基后移入培養(yǎng)室，光照度為1 500 lx，光照時(shí)間9 h/d，溫度(26±2)℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同6-BA濃度對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

從表1可知，隨著6-BA濃度的升高，誘導(dǎo)芽數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)。6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，莖尖外植體只是抽長(zhǎng)，基部無(wú)新芽分化；6-BA為2.0、3.0 mg/L時(shí)，平均芽數(shù)分別為2.84、2.80個(gè)，芽生長(zhǎng)正常；6-BA濃度升高到 4.0 mg/L 時(shí)，平均芽數(shù)下降為2.68個(gè)，且芽較短；6-BA濃度增高至5.0 mg/L時(shí)，分化芽繼續(xù)降低，且芽細(xì)?？梢?jiàn)，誘導(dǎo)叢生芽較好的6-BA濃度為2.0～3.0 mg/L。

表1 不同6-BA濃度對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.2 不同倍量MS培養(yǎng)基對(duì)叢生芽增殖的效果

從表2看出，不同倍量MS培養(yǎng)基對(duì)土田七叢生芽增殖的影響不同。在1/4～1倍的MS，叢生芽的增殖系數(shù)與無(wú)機(jī)鹽的用量成正比，全量MS時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)最大值，為3.11，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽用量繼續(xù)增大到3/2 MS時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)減小，為2.42。從芽的生長(zhǎng)情況看，1/4 MS培養(yǎng)基的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)較差，芽細(xì)小，有少量葉片呈黃色，其中2芽心葉枯死，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，黃化葉的數(shù)量增多，黃化程度加重；1/2 MS 培養(yǎng)基的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)也較差，芽較細(xì)小，少數(shù)葉片的上半部出現(xiàn)淡黃色斑點(diǎn)，以后葉片出現(xiàn)慢慢變黃；3/4 MS培養(yǎng)基的叢生芽稍粗，葉色綠；MS培養(yǎng)基的叢生芽生長(zhǎng)健壯，芽長(zhǎng)，葉色綠；3/2 MS培養(yǎng)基的叢生芽也生長(zhǎng)良好，葉呈綠色，但芽較MS的略短。從數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果看，MS與其他無(wú)機(jī)鹽處理之間的差異達(dá)到顯著水平，因此，宜選用全量MS進(jìn)行土田七叢生芽的增殖培養(yǎng)。

表2 不同MS無(wú)機(jī)鹽用量對(duì)叢生芽增殖的影響

注：同列數(shù)值后不同小寫(xiě)字母表示0.05水平上差異顯著。下表同。

2.3 6-BA與NAA配比對(duì)叢生芽增殖的影響

從表3可以看出，單獨(dú)使用6-BA，在0.5～3.0 mg/L范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的升高，芽的增殖系數(shù)也提高，6-BA濃度達(dá)到4.0 mg/L時(shí)，芽的增殖系數(shù)下降。6-BA 0.5～1.0 mg/L 時(shí)，與NAA各組合的芽增殖系數(shù)均在2左右，同一6-BA濃度的組合多差異不顯著，但叢生芽的生長(zhǎng)狀況差異較大，不含NAA的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的叢生芽粗，基部根很少，而含有0.2 、0.5 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的芽較細(xì)，根系多。當(dāng)6-BA為2.0 mg/L時(shí)，與NAA配比的2個(gè)組合的增殖系數(shù)大于單一的6-BA處理，各組合的芽增殖系數(shù)在3以上，但3者無(wú)顯著性差異，其芽生長(zhǎng)健壯，基部不同程度地生根；6-BA 增加至3.0 mg/L時(shí)，各處理培養(yǎng)基所培養(yǎng)的分化芽增殖系數(shù)都較高，6-BA與0.2 mg/L NAA配合時(shí)芽的增殖系數(shù)最大，達(dá)4.32，且芽生長(zhǎng)勢(shì)好(圖1)。但當(dāng)6-BA濃度達(dá)到 4.0 mg/L 時(shí)，芽的增殖系數(shù)反而下降到2.56～3.16，芽的生長(zhǎng)勢(shì)也較差，芽多細(xì)小，平均芽高 1.6 cm，不利于后續(xù)的生根培養(yǎng)。綜合看來(lái)，土田七叢生芽增殖的適宜配方是MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖。

表3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)芽增殖的影響

2.4 不同倍性MS培養(yǎng)基對(duì)再生芽生根的影響

土田七再生芽接入生根培養(yǎng)基中，1/2MS培養(yǎng)基最早發(fā)根，5 d 長(zhǎng)出新根，1/4MS于培養(yǎng)7 d長(zhǎng)根，3/4MS和MS則培養(yǎng) 8 d 后開(kāi)始長(zhǎng)根，培養(yǎng)30 d后4種培養(yǎng)基中的小苗生根率均達(dá)到100%。從表4可以看出，1/4MS處理植株的生長(zhǎng)表現(xiàn)差，葉片和葉柄黃化，植株較矮小，平均株高只有6.50 cm，根數(shù)少，平均每株生根8.11條，誘導(dǎo)的根系也較短(圖2)。1/2 MS的植株葉片也有少量的黃化現(xiàn)象(圖3)，但生根數(shù)最多，達(dá)到10.19條，其株高最高，為8.25 cm，這可能與根系早發(fā)且多有利于吸收營(yíng)養(yǎng)從而促進(jìn)植株的生長(zhǎng)有關(guān)。3/4 MS和MS培養(yǎng)的植株無(wú)明顯差異，植株生長(zhǎng)勢(shì)好，葉色綠(圖4)，平均株高7.95、8.13 cm，誘導(dǎo)的根數(shù)分別為9.31、9.45條，平均根長(zhǎng)2.38、2.52 cm，但培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至45 d后，3/4 MS上的植株葉片葉梢開(kāi)始變黃，以后逐漸增多，而MS培養(yǎng)的植株60 d后仍為綠色。方差分析結(jié)果表明，1/4 MS與1/2MS、3/4MS、MS 3種處理在株高、根數(shù)和根間存在顯著性差異；1/2 MS的根數(shù)顯著高于3/4MS和MS，株高和根最長(zhǎng)則差異不顯著，但1/2 MS植株葉片有黃化現(xiàn)象，說(shuō)明土田七所需的無(wú)機(jī)鹽濃度較高，1/2 MS無(wú)機(jī)鹽濃度不能滿足植株生長(zhǎng)需求，以 3/4MS～MS為適宜濃度，從規(guī)?；a(chǎn)成本考慮，宜選用3/4 MS，如延長(zhǎng)培養(yǎng)周期，則可選用MS，全量的無(wú)機(jī)鹽濃度可以滿足植株較長(zhǎng)時(shí)間的營(yíng)養(yǎng)，保證植株的質(zhì)量。

2.5 不同生長(zhǎng)素培養(yǎng)基對(duì)再生芽生根的影響

土田七小苗較易生根，在無(wú)生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中，小苗生根率也能達(dá)到100%，但發(fā)根較慢，根數(shù)少，平均每株生根5.52條，長(zhǎng)出的根較短細(xì)，植株較矮小，最小株高只有4 cm，平均株高6.48 cm(表5)。含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基，植株長(zhǎng)勢(shì)良好，株高最小值為7.21 cm，最高的達(dá)到8.16 cm；單一使用NAA，株高與NAA濃度成正比；NAA與IBA 0.1 mg/L配合時(shí)，株高值也隨著NAA濃度的升高而加大；當(dāng)IBA 0.2 mg/L時(shí)，以 0.2 mg/L NAA時(shí)的株高為最大。就生根數(shù)量來(lái)看，在一定的范圍內(nèi)，植株的根系發(fā)生似乎與生長(zhǎng)素的絕對(duì)值(總含量成正比，在0.2～0.6 mg/L的濃度之間，隨著生長(zhǎng)素濃度的加大，生根數(shù)量增多，0.6 mg/L NAA對(duì)根系的發(fā)生影響最大，根數(shù)達(dá)到9.74條，植株健壯(圖4)；0.6 mg/L NAA與IBA配合，誘導(dǎo)的根數(shù)減少。從根系的生長(zhǎng)情況看，低濃度誘導(dǎo)的根系較為細(xì)長(zhǎng)，生長(zhǎng)素濃度達(dá)到0.4 mg/L后，生成的根粗且長(zhǎng)。差異顯著性分析表明，0.6 mg/L NAA、0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA、0.4 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA 3個(gè)處理間的差異不顯著，但3者與其他生長(zhǎng)素處理間則多存在顯著性差異。綜合考慮，MS+0.6 mg/L NAA+30 g/L蔗糖應(yīng)是土田七的最佳誘根培養(yǎng)基，采用MS+0.4 mg/L NAA+0.1～0.2 mg/L IBA+30g/L蔗糖也有良好的效果。

表4 不同無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)生根的影響

表5 不同生長(zhǎng)素濃度對(duì)根系分化的的影響

3 結(jié)論與討論

已有的姜科植物組織培養(yǎng)研究報(bào)道中也多采用莖尖或者莖段作為接種外植體直接誘導(dǎo)芽增殖途徑進(jìn)行繁殖[2-14]。本研究預(yù)試驗(yàn)中曾用土田七的根莖和葉片作為外植體，發(fā)現(xiàn)存在根莖易污染，葉片易褐化且難以誘導(dǎo)出愈傷組織的問(wèn)題。采用土田七的莖尖作為外植體，由于該材料生長(zhǎng)于地上，帶菌量相對(duì)較少，且有葉鞘包裹，感染雜菌的概率低，加之莖尖外表較光滑，消毒效果好，材料污染率低。莖尖基部幼芽長(zhǎng)出快，數(shù)量多，這可能與莖尖組織分生能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快有著一定的關(guān)系[15]，因此，莖尖是土田七組培快繁理想的外植體材料。

適宜的無(wú)機(jī)鹽濃度是培養(yǎng)中的細(xì)胞所必需的，然而不同植物的芽苗對(duì)其無(wú)機(jī)鹽濃度的要求不一致。姜科植物組織培養(yǎng)研究報(bào)道中多采用MS培養(yǎng)基進(jìn)行芽的誘導(dǎo)和增殖，生根培養(yǎng)階段不同的姜科種類(lèi)對(duì)無(wú)機(jī)鹽的要求有所不同。戚華沙等在姜黃的離體培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，1/2MS、3/4MS、MS等3種無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)芽增殖系數(shù)的影響差異不顯著，但對(duì)芽苗的生長(zhǎng)勢(shì)有一定的影響，以MS為增殖和生根最佳濃度[14]。范燕萍等在紅球姜的組織培養(yǎng)與快速繁殖中，MS為生根最佳無(wú)機(jī)鹽濃度[4]。文慧婷等用1/2 MS誘導(dǎo)瓷玫瑰幼芽生根，發(fā)根早，且根多而粗壯[8]。熊友華等用種子胚研究圓瓣姜花的繁殖技術(shù)，認(rèn)為低無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度的1/2 MS培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更有利于其生根[16]。本研究中，全量的MS無(wú)機(jī)鹽對(duì)土田七芽增殖效果最好，3/4MS～MS可以滿足生根培養(yǎng)的要求。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)、水平以及相互組合的選擇對(duì)組織的產(chǎn)生與分化十分重要。6-BA和NAA的組合有利于土田七外植體的芽誘導(dǎo)及芽的增殖，但最佳配比水平有所不同。土田七芽誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)中，在0.5 mg/L的NAA條件下，添加不同濃度的6-BA，芽的萌發(fā)率有一定的差別。當(dāng)添加6-BA濃度為2.0～3.0 mg/L時(shí)，有利于新芽的分化，平均每個(gè)莖尖可長(zhǎng)出近3個(gè)幼芽。芽的增殖培養(yǎng)中，3.0 mg/L 6-BA與0.2 mg/L NAA配合時(shí)，幼芽多，且粗壯，平均芽增殖系數(shù)達(dá)到4.32，該配比是幼芽增殖的最佳組合。

土田七組培苗生根比較容易，即使在無(wú)激素環(huán)境下也能夠長(zhǎng)出根，但效果較差，低濃度的生長(zhǎng)素水平生根效果也較差。單獨(dú)使用NAA，濃度為0.6 mg/L時(shí)，獲得最佳生根效果，平均生根數(shù)9.74條，根粗壯、發(fā)達(dá)，植株長(zhǎng)勢(shì)好。NAA和IBA配合使用時(shí)也能達(dá)到良好的效果，適宜的濃度為NAA 0.4 mg/L，IBA 0.1～0.2 mg/L。

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